구강점막(oral mucosa)의 상피는 뛰어난 재생능력을 가진 조직으로 줄기세포(stem cell)가 분포하여 이 치유과정에 관여한다고 예상되고 있다. 성체(adult)의 조직내 분포하는 줄기세포는 손상(injury)을 입었을 때 그 수가 증가하며 재생 기능을 수행한다. 따라서 본 연 ...

구강점막(oral mucosa)의 상피는 뛰어난 재생능력을 가진 조직으로 줄기세포(stem cell)가 분포하여 이 치유과정에 관여한다고 예상되고 있다. 성체(adult)의 조직내 분포하는 줄기세포는 손상(injury)을 입었을 때 그 수가 증가하며 재생 기능을 수행한다. 따라서 본 연구에서는 구강점막에 손상을 주는 세가지 모델, 스크래치(scratch), 화학물질 처리(chemical burn)와 레이저(laser)에 의한 모델 시스템을 이용하였다. 각 모델에서 구강점막이 손상됨을 확인하였고, 재생시간을 다르게 하여 줄기세포가 나타남을 확인하였다. 줄기세포는 느리게 세포 분열하는 특징을 가지므로 BrdU라는 물질을 처리하여 일정시간이 지난 후에도 BrdU로 표지된 DNA가 있음을 검출하여 줄기세포를 확인하였다. 각 모델에서 손상을 가한 후, 24, 48, 72시간 후에 BrdU가 남아있는 세포들이 관찰되었고, 이 세포들은 구강 점막 상피의 기저층에 위치하고 있다. 이 결과를 통해 구강점막의 상피에 재생에 관여하는 줄기세포가 있음을 증명하였다. 또한, 구강점막의 손상 모델의 구축과 BrdU를 이용한 줄기세포의 검출 방법은 다른 장기의 재생 연구에도 유용하게 이용될 것이다. 구강점막 상피에 존재하는 줄기세포의 분리와 이를 이용한 구강 내 다른 구조로의 분화. 재생 연구가 더욱 진행되어야 할 것이다.

The epithelial cells in the oral mucosa undergoes a rapid wound-healing process without forming any scar. Stem cells in the oral mucosa are expected to involve in the healing process and have a remarkable capacity for regeneration of the tissue. In ad ...

The epithelial cells in the oral mucosa undergoes a rapid wound-healing process without forming any scar. Stem cells in the oral mucosa are expected to involve in the healing process and have a remarkable capacity for regeneration of the tissue. In adult tissue, stem cells are activated by injury and then proliferate through asymmetrical cell division, which one cell transiently amplifies and another remains as a stem cell. Stem cells can be identified by BrdU-labeling method because of their slow-cycling property. Bromodeoxyuridine (BrdU) integrate into newly synthesized DNA and is gradually diluted after each cell division. Therefore, some cells undergoing slow cell cycle contain BrdU-labeled DNA. These cells are named label-retaining cells (LRC) having the stem cell potential. In this study, we used BrdU-labelling method after giving injury to the oral mucosa to confirm the localization of stem cells in the oral mucosa. First, we should construct the wound-healing model in the oral mucosa, therefore we used three models, such as scratch, chemical burning, and laser model. We confirmed injury by treatment of each model, and time dependent regeneration (0, 24, 48, 72 hours, and 1 week). BrdU-labeled cells were detected after 24 hours of healing and these cells remained after 48 and 72 hours. Most of these cells localized in the basal layer of the epithelium and moved forwards the wound area to function in the healing process. In this study, we suggested a good wound-healing model for oral mucosa research and BrdU-labelling method for stem cell study. We will proceed this project on the basis of these methods and results. We plan to isolate stem cells from oral mucosa and differentiate stem cells into functional cells in further study.

구강점막(oral mucosa)의 상피는 뛰어난 재생능력을 가진 조직으로 줄기세포(stem cell)가 분포하여 이 치유과정에 관여한다고 예상되고 있다. 성체(adult)의 조직내 분포하는 줄기세포는 손상(injury)을 입었을 때 그 수가 증가하며 재생 기능을 수행한다. 따라서 본 연 ...

구강점막(oral mucosa)의 상피는 뛰어난 재생능력을 가진 조직으로 줄기세포(stem cell)가 분포하여 이 치유과정에 관여한다고 예상되고 있다. 성체(adult)의 조직내 분포하는 줄기세포는 손상(injury)을 입었을 때 그 수가 증가하며 재생 기능을 수행한다. 따라서 본 연구에서는 구강점막에 손상을 주는 세가지 모델, 스크래치(scratch), 화학물질 처리(chemical burn)와 레이저(laser)에 의한 모델 시스템을 이용하였다. 각 모델에서 구강점막이 손상됨을 확인하였고, 재생시간을 다르게 하여 줄기세포가 나타남을 확인하였다. 줄기세포는 느리게 세포 분열하는 특징을 가지므로 BrdU라는 물질을 처리하여 일정시간이 지난 후에도 BrdU로 표지된 DNA가 있음을 검출하여 줄기세포를 확인하였다. 각 모델에서 손상을 가한 후, 24, 48, 72시간 후에 BrdU가 남아있는 세포들이 관찰되었고, 이 세포들은 구강 점막 상피의 기저층에 위치하고 있다. 이 결과를 통해 구강점막의 상피에 재생에 관여하는 줄기세포가 있음을 증명하였다. 또한, 구강점막의 손상 모델의 구축과 BrdU를 이용한 줄기세포의 검출 방법은 다른 장기의 재생 연구에도 유용하게 이용될 것이다. 구강점막 상피에 존재하는 줄기세포의 분리와 이를 이용한 구강 내 다른 구조로의 분화. 재생 연구가 더욱 진행되어야 할 것이다.

▣ 연구 내용 및 방법
구강 점막(oral mucosa) 상피는 상처의 치유속도가 빠르고, 흉터가 생기지 않는 등 강한 재생능력의 특징을 가지고 있다. 따라서 구강점막의 상피에는 줄기세포가 존재할 거라 예상할 수 있다. 본 연구에서는 구강점막 내의 줄기세포가 있음을 확인 ...

▣ 연구 내용 및 방법
구강 점막(oral mucosa) 상피는 상처의 치유속도가 빠르고, 흉터가 생기지 않는 등 강한 재생능력의 특징을 가지고 있다. 따라서 구강점막의 상피에는 줄기세포가 존재할 거라 예상할 수 있다. 본 연구에서는 구강점막 내의 줄기세포가 있음을 확인하고, 구강점막에 가해질 수 있는 여러 종류의 손상 모델을 구축하여 구강점막 내 줄기세포가 치유에 관여함을 확인하고자 하였다.
줄기세포의 존재와 구강 점막내의 분포 위치를 확인하고자 bromodeoxyuridine(BrdU)을 이용하였다. 흰쥐에 BrdU를 주입하면 BrdU는 새로 합성되는 DNA로 끼어들어가 분열하는 세포를 표지하게 된다. 일정 기간 주입된 BrdU는 빠르게 분열하는 세포에서는 여러 번의 분열로 인해 DNA상에서 희석되어 나타나지 않는 반면, 줄기세포의 기능을 하는 세포는 느리게 세포 분열하므로 일정기간이 지나도 BrdU가 나타나는 특징을 가진다. BrdU가 남아 있는 세포를 label-retaining cell(LRC)라 하고 이 세포는 줄기세포의 기능을 할 가능성을 가지고 있다. 또한, BrdU를 포함하고 있는 세포가 LRC인지 단순한 분열세포 인지를 판별하기 위하여 proliferating cell nuclear antigen(PCNA)와 이중으로 염색하여 줄기세포의 특성을 가짐을 확인하였다.
1) 구강 점막의 손상 모델
- scratch damage model, chemical burn model(NaOH / HCl), laser damage model
2) BrdU-labelling method
- Embryo stage 12 (E12) 시기의 배아를 임신한 흰쥐에 BrdU를 1주간 주사하고, 3주간 chasing하여 LRC를 확인함.
3) 면역조직화학염색법
- BrdU, proliferating cell nuclear antigen 항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 통해 줄기세포를 확인함. DAPI 염색을 통해 대비염색함.

▣ 연구 결과
1) Scratch damage model
- 손상 후 바로 확인한 결과 (0 시간), BrdU에 의해 관찰되는 세포는 없었음. 또한, 세포 분열의 표지가 되는 PCNA도 검출되지 않음.
- 손상 후 24, 48, 72시간 후, 구강점막의 손상된 부위에서 적은 수지만 BrdU-labeled cell이 관찰됨. 또한 분열이 활발한 세포도 상피의 기저층 (basal layer)에서 PCNA에 의해 관찰됨.
- 손상 후 1주 후에도 기저층에서 BrdU가 검출되는 세포가 있음.
2) Chemical burn model (NaOH / HCl)
- NaOH와 HCl의 농도별 처리 결과, NaOH 1.0N의 조건이 실험 모델로 적당함을 확인함.
- 24, 48시간 경과 후, 상피와 결합조직에서 세포분열이 일어나고 있고, 상피 아래부위로 결합조직 세포들이 이동하고 있음을 확인함.
- 72시간 재생 후, 상피의 기저층 세포들이 손상부위의 중간까지 이용하고 있음.
- 1주 후, 기저층 세포들이 손상부위까지 재생하여 더 이상 이동하지 않음.
- 시간대별로 손상된 부위에서 BrdU로 표지된 세포가 상피의 중간층까지 올라와 재생에 관여하고 있음을 확인함.
3) Laser damage model
- 1주 BrdU 주사 후 3주간 chasing한 쥐의 구강점막에 sand paper를 이용하여 손상을 가함.
- 손상 후, 0시간에는 BrdU와 PCNA는 검출되지 않음.
- 24, 48, 72시간 경과 후, 상처 부위에서 BrdU가 관찰되고, PCNA 또한 구강점막에서 관찰됨.

▣ 결론 및 활용방안
배아의 줄기세포와는 달리 성체에서 존재하는 줄기세포는 각 장기에서 적은 수로 분포하고 있다. 따라서 성체의 줄기세포를 이용하기 위해서는 줄기세포의 분포를 확인하고 줄기세포의 수를 늘리는 단계가 수행되어야 한다. 각 장기별로 손상을 주는 모델이 구축되어 있고, 이 실험 방법을 통해 성체줄기세포의 연구가 진행되고 있다. 구강 내 구강점막은 일반 피부보다도 더 빠른 재생능력을 가지고 있어 줄기세포 연구에 적합한 구조가 될 수 있다. 본 연구에서는 구강점막의 손상 모델을 통해 줄기세포의 분열을 자극하고 이 세포들이 치유에 관여함을 확인하였다.
본 연구를 통한 실험방법과 결과는 구강점막의 손상-치유 모델을 체계적으로 보여줌으로써 구강점막 연구 분야에서 다양한 방법을 제시하였다. 또한, 줄기세포를 동정하는 방법으로 BrdU-labelingl system을 구축하여 다른 장기에서도 이용할 수 있다. 실제로 본 연구자가 일본의 동경치과대학팀과 본 연구를 구상, 진행하면서 확립한 줄기세포 연구 방법은 귀국 후, 본 연구팀(연세대학교 치과대학)에서 구강 내 다른 구조물, 치아나 침샘의 줄기세포 연구에 응용되고 있다.
구강점막 내 상피에 줄기세포의 분포와 치유과정에 관여함을 확인하였으므로 이 줄기세포만을 분리하고, 기능을 가진 세포들로의 분화를 유도할 수 있는 연구로 더욱 진행되어야 할 것이다.