2004년 7월부터 2005년 1월까지 백혈병관련항원이 양성인 총 1168개의 골수검체를 이용하여 qualitative nested PCR 및 real-time quantitative PCR을 수행하기 위한 primer 및 probe를 제작하고 각각의 PCR 증폭을 위한 최적의 실험조건을 확립하고 표준화하는 작업을 수 ...

2004년 7월부터 2005년 1월까지 백혈병관련항원이 양성인 총 1168개의 골수검체를 이용하여 qualitative nested PCR 및 real-time quantitative PCR을 수행하기 위한 primer 및 probe를 제작하고 각각의 PCR 증폭을 위한 최적의 실험조건을 확립하고 표준화하는 작업을 수행하였다. 약술하면 (1) 골수검체로부터 RNA를 분리하고 cDNA를 합성한 다음, (2) qualitative nested PCR 및 real-time quantitative PCR 을 수행하기 위한 백혈병관련항원의 primer/probe를 제작하였고, (3) 각각의 PCR 증폭조건을 다각도로 검토하여 각 항원에 따른 최적의 표준화조건을 확립하였고, (4) 이를 검증하기 위해 백혈병관련항원의 transcript 발현양상 및 kinetics와 실제 임상경과와의 연관성을 규명하였다. 이에 대한 연구결과를 요약하면, (1) BCR-ABL tyrosine kinase inhibitor인 imatinib을 이용한 치료를 항암화학요법과 병행한 후 동종조혈모세포이식을 시행받았던 BCR-ABL 백혈병관련항원이 양성인 29명의 급성림프구성백혈병 환자를 대상으로 분석한 결과, 이들의 각 치료단계 별 transcript copy number의 감소양상이 치료반응과 매우 밀접한 연관성이 있음을 확인하였다. Imatinib 치료반응군에서는 BCR-ABL/ABL ratio가 1차치료 후 0.77 log, 2차치료 후 0.34 log 감소되었던 반면, 불응성이거나 재발한 환자의 경우에서는 BCR-ABL/ABL ratio가 증가됨을 입증함으로써, 본 연구자가 표준화시킨 RQ-PCR 및 qualitative nested PCR 검사기법의 정확도를 확인하였다(Blood. 2005;105:3449-3457, IF=9.782). (2) PML-RARα 백혈병관련항원이 양성인 70명의 환자를 대상으로 각 transcript 발현양상 및 kinetics와 임상경과와의 연관성 또한 분석하였는데, 마찬가지로 이들의 각 치료단계 별 transcript copy number의 감소양상이 치료반응과 매우 밀접한 연관성이 있음을 확인하였으며, 특히 1차공고요법 후 발현되는 PML-RARα/ABL ratio가 10^-3 이상인 경우 재발과 매우 밀접한 연관성이 있음을 확인하였다 (Haematologica/The Hematology Journal, 논문심사교정 중).
이상의 실험과정 및 분석을 바탕으로 부조직적합항원(mHag)의 발현분석을 위한 기반을 동시에 확립하였고, 2005년 2월부터 2005년 6월 귀국 전까지 mHag을 표적으로 하는 cytotosic T lymphocyte (CTL) 제조 및 증폭에 관한 연구를 시행하였다. 우선 dog leukocyte antigen (DLA)-identical transplant canine model을 이용하여 dendritic cell (DC)의 배양 및 항원제공능을 항진시킬 수 있는 최적조건을 확립하였다. 약술하면, DLA가 일치하는 공여자로부터 골수를 채취하여 CD34+ 세포를 분리한 다음 14일간 배양하였으며, 이후 mHag-specific CTL 증폭을 위해 responder의 단핵구를 배양하면서 10:1 비율로 stimulator인 DC를 반복적으로 restimulation하는 방법을 정립하였고, proliferation assay (3[H]TdR incorporation), 51Cr release assay, flow cytometry, ELISA 및 ELISPOT을 시행하여 CTL activity를 측정하였다.
본 연구의 수행은 향후 한국인의 독특한 백혈병관련항원 및 HLA 유형에 근거한 표적항원-specific CTL 제조 및 이를 이용한 세포면역요법의 개발을 앞당기는데 기여할 것으로 판단된다.

Between July 2004 and January 2005, we started a process to standardize qualitative nested PCR and real-time quantitative PCR (RQ-PCR) assays using 1168 bone marrow (BM) samples which were leukemia-associated antigen-positive. Briefly, (1) Total RNA w ...

Between July 2004 and January 2005, we started a process to standardize qualitative nested PCR and real-time quantitative PCR (RQ-PCR) assays using 1168 bone marrow (BM) samples which were leukemia-associated antigen-positive. Briefly, (1) Total RNA was extracted and reverse transcription was performed. (2) We designed 1 set of primers for each type of transcript, reference ABL, and TaqMan probes. (3) After then, qualitative and quantitative PCR were performed with the standard conditions in triplicate. (4) We also undertook a study to clarify the significance of each transcript expression level and of its kinetics over the entire treatment course in patients having leukemia-associated antigen. The results were as follows: (1) Twenty-nine patients with Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia who were treated with imatinib incorporation into conventional chemotherapy as an alternative and intended to undergo allogeneic stem cell transplantation (SCT) were enrolled in this study. To evaluate the BCR-ABL transcript expression and its kinetics, 272 BM samples were analyzed by qualitative and RQ-PCR. After the first imatinib cycle, the median BCR-ABL/ABL ratios decreased by 0.77 log in 25 (86.2%) responders, and their BCR-ABL/ABL ratios decreased further by 0.34 log after the second imatinib cycle, which included 7 molecular complete remission. One patient (4.3%) relapsed during the imatinib therapy. The remaining 3 patients were primarily refractory to both imatinib and chemotherapy. BCR-ABL transcript expression level and its kinetics were found to correlate well with the clinical courses of all patients (Blood. 2005;105:3449-3457, IF=9.782). (2) Seventy adults with PML-RARα-positive APL who achieved hematologic remission after an identical induction and intended to undergo consolidation and maintenance schedules were enrolled in this study. To evaluate the PML-RARα transcript expression and its kinetics, 762 BM samples were analyzed by qualitative and RQ-PCR. After induction, 34 (49.3%) of 69 evaluable patients achieved molecular remission. In the remaining 35 patients, the median PML-RARα/ABL ratio decreased by 3.14 log. After first consolidation, 23 of the 35 patients who were PCR-positive after induction became PCR-negative. In the remaining 12 patients, the median PML-RARα/ABL ratio decreased by 1.28 log. At a median follow-up of 44 months, PML-RARα/ABL ratio of greater than 10^-3 after first consolidation was the most powerful predictor of relapse (85.7% versus 7.3%, p<0.001) and DFS (14.3% versus 91.2%, p<0.001) (Haematologica/The Hematology Journal, in processing).
From February 2005 to June 2005, we undertook a study to standardize a protocol for minor histocompatibility antigen (mHag)-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) generation and ex vivo expansion. First, using dog leukocyte antigen (DLA)-identical transplant canine model, donor dendritic cells were cultured from BM-derived CD34+ cells and were used to stimulate recipient T lymphocytes on days 1, 10, and 20 of CTL culture at a 10:1 ratio, respectively. Before each restimulation, mHag-specific CTL activity was assessed using proliferation assay (3[H]TdR incorporation), 51Cr release assay, flow cytometry, ELISA, and ELISPOT. These results and experiences may allow us to develop an novel cellular immunotherapy using leukemia-associated antigen or mHag-targeted CTL for Korean population in the near future.

2004년 7월부터 2005년 1월까지 백혈병관련항원(BCR-ABL, PML-RARα, etc)이 양성으로 발현되는 총 1168개의 골수검체를 이용하여 qualitative nested PCR 및 real-time quantitative PCR (RQ-PCR)을 수행하기 위한 primer 및 probe를 제작하고 각각의 PCR 증폭을 위한 최 ...

2004년 7월부터 2005년 1월까지 백혈병관련항원(BCR-ABL, PML-RARα, etc)이 양성으로 발현되는 총 1168개의 골수검체를 이용하여 qualitative nested PCR 및 real-time quantitative PCR (RQ-PCR)을 수행하기 위한 primer 및 probe를 제작하고 각각의 PCR 증폭을 위한 최적의 실험조건을 확립하고 표준화하는 작업을 수행하였다. 약술하면 (1) 골수검체로부터 RNA를 분리하고 cDNA를 합성한 다음, (2) qualitative nested PCR 및 RQ-PCR을 수행하기 위한 백혈병관련항원의 primer/probe를 제작하였고, (3) 각각의 PCR 증폭조건을 다각도로 검토하여 각 항원에 따른 최적의 표준화조건을 확립하였고, (4) 이를 검증하기 위해 백혈병관련항원의 transcript 발현양상 및 kinetics와 실제 임상경과와의 연관성을 규명하였다. 이상의 실험과정 및 분석을 바탕으로 부조직적합항원(mHag)의 발현분석을 위한 기반을 동시에 확립하였고, 2005년 2월부터 2005년 6월 귀국 전까지 mHag을 표적으로 하는 cytotosic T lymphocyte (CTL) 제조 및 증폭에 관한 연구를 시행하였다. 본 연구의 수행은 향후 한국인의 독특한 백혈병관련항원 및 HLA 유형에 근거한 표적항원-specific CTL 제조 및 이를 이용한 세포면역요법의 개발을 앞당기는데 기여할 것으로 판단된다.

(1) BCR-ABL tyrosine kinase inhibitor인 imatinib을 이용한 치료를 항암화학요법과 병행한 후 동종조혈모세포이식을 시행받았던 BCR-ABL 백혈병관련항원이 양성인 29명의 급성림프구성백혈병 환자를 대상으로 분석한 결과, 이들의 각 치료단계 별 transcript copy numb ...

(1) BCR-ABL tyrosine kinase inhibitor인 imatinib을 이용한 치료를 항암화학요법과 병행한 후 동종조혈모세포이식을 시행받았던 BCR-ABL 백혈병관련항원이 양성인 29명의 급성림프구성백혈병 환자를 대상으로 분석한 결과, 이들의 각 치료단계 별 transcript copy number의 감소양상이 치료반응과 매우 밀접한 연관성이 있음을 확인하였다. Imatinib 치료반응군에서는 BCR-ABL/ABL ratio가 1차치료 후 0.77 log, 2차치료 후 0.34 log 감소되었던 반면, 불응성이거나 재발한 환자의 경우에서는 BCR-ABL/ABL ratio가 증가됨을 입증함으로써, 본 연구자가 표준화시킨 RQ-PCR 및 qualitative PCR 검사기법의 정확도를 확인하였다(Blood. 2005;105:3449-3457, IF=9.782).
(2) PML-RARα 백혈병관련항원이 양성인 70명의 환자를 대상으로 각 transcript 발현양상 및 kinetics와 임상경과와의 연관성 또한 분석하였는데, 마찬가지로 이들의 각 치료단계 별 transcript copy number의 감소양상이 치료반응과 매우 밀접한 연관성이 있음을 확인하였으며, 특히 1차공고요법 후 발현되는 PML-RARα/ABL ratio가 10^-3 이상인 경우 재발과 매우 밀접한 연관성이 있음을 확인하였다 (Haematologica/The Hematology Journal, 논문심사교정 중).
(3) Dog leukocyte antigen (DLA)-identical transplant canine model을 이용하여 mHag-specific CTL을 효과적으로 체외증폭시키고자 dendritic cell (DC)의 배양 및 항원제공능을 항진시킬 수 있는 최적조건을 확립하였다. 약술하면, DLA가 일치하는 공여자로부터 골수를 채취하여 CD34+ 세포를 분리한 다음 14일간 배양하였으며, 이후 mHag-specific CTL 증폭을 위해 responder의 단핵구를 배양하면서 10:1 비율로 stimulator인 DC를 반복적으로 restimulation하는 방법을 정립하였고, 각각의 restimulation 시행 직전에 proliferation assay (3[H]TdR incorporation), 51Cr release assay, flow cytometry, ELISA 및 ELISPOT을 시행하여 CTL activity를 측정하였다. 본 연구의 수행은 향후 한국인의 독특한 백혈병관련항원 및 HLA 유형에 근거한 표적항원-specific CTL 제조 및 이를 이용한 세포면역요법의 개발을 앞당기는데 기여할 것으로 판단된다.