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https://www.krm.or.kr/krmts/link.html?dbGubun=SD&m201_id=10005300&local_id=10010563
Regulation of sphingosine 1-phosphate function on neovascular biology
Reports NRF is supported by Research Projects( Regulation of sphingosine 1-phosphate function on neovascular biology | 2004 Year | 이용문(충북대학교) ) data is submitted to the NRF Project Results
Researcher who has been awarded a research grant by Humanities and Social Studies Support Program of NRF has to submit an end product within 6 months(* depend on the form of business)
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  • Researchers have entered the information directly to the NRF of Korea research support system
Project Number E00002
Year(selected) 2004 Year
the present condition of Project 종료
State of proposition 재단승인
Completion Date 2005년 08월 23일
Year type 결과보고
Year(final report) 2005년
Research Summary
  • Korean
  • 스핑고신 일인산(So1P)은 수용체인 EDG와 결합하여 혈관 내피세포 및 혈관평활근 세포의이동(migration)을 촉진하여 혈관신생을 유도한다. 본 연구는 배아 발생과정에서 혈관형성에 So1P가 관여하는 정도를 정량화 하기 위하여, 모체와 분리된 닭의 유정란, 마우스 배아를 사용하여, 발생시기와 So1P의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 마우스의 경우, 혈관 발생초기인 E8.5 시기에 So1P가 높게 나타났으며, 이는 So1P가 혈관 발생초기 migration이 필요한 시기에 집중적으로 필요함을 추정할 수 있었다. 유정란에서는 So1P의 변화는 상대적으로 적었으나, 스핑고신의 함량이 초기배아에 고농도로 분포하는 점으로 미루어보아, 모체와 격리된 조류의 혈관발생 과정에 관여하는 So1P의 기능은 포유류와 달게 진행될 수 있다는 추정할 수 있었다. 한편, 세포내의 스핑고지질 대사계의 변화가 migration에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, So1P의 농도를 조절하는 효소, S1Pl yase 및 Sphk를 deletion 또는 overexpression한 안정된 F9 mutant 세포를 사용하여, So1P에 대한 주화성(chemotaxis)를 검토하였다. 그 결과, F9 세포는 So1P에 대한 농도의존적 주화성을 나타내며, 특히 S1P lyase deletion이 migration을 약간 억제하는 것처럼 나타나나, 상세한 기전은 검토중이다.
  • English
  • Angiogenesis is induced by the migration of endothelial cells or vascular smooth muscle cells by sphingosine 1-phosphate (So1P), which binds to its receptor, EDG. This research focused on the critical role of So1P on the vascular development in chicken embryo and mouse embryo with edg deletion mutants. The analysis of So1P during development revealed that the higher So1P may be required on early stage of vascular development. This result suggests that So1P is an essential component in early vascular development. Based on the result obtained from So1P and So analysis on chicken embryo, the process of vascular development in chicken, which is isolated from maternal, shows sphingosine increase and Sphk activity high.
    For the purpose of the study for precise mechanism of cell migration, F9 deletion mutants, which is deleted S1P lyase and/or the overexpression of Sphk. The chemotaxis study showed that S1P lyase deletion shows the decreased migration, however, more precise studies may require in near future.
Research result report
  • Abstract
  • 스핑고신 일인산(So1P)은 수용체인 EDG와 결합하여 혈관 내피세포 및 혈관평활근 세포의이동(migration)을 촉진하여 혈관신생을 유도한다. 본 연구는 배아 발생과정에서 혈관형성에 So1P가 관여하는 정도를 정량화 하기 위하여, 모체와 분리된 닭의 유정란, 마우스 배아를 사용하여, 발생시기와 So1P의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 마우스의 경우, 혈관 발생초기인 E8.5 시기에 So1P가 높게 나타났으며, 이는 So1P가 혈관 발생초기 migration이 필요한 시기에 집중적으로 필요함을 추정할 수 있었다. 유정란에서는 So1P의 변화는 상대적으로 적었으나, 스핑고신의 함량이 초기배아에 고농도로 분포하는 점으로 미루어보아, 모체와 격리된 조류의 혈관발생 과정에 관여하는 So1P의 기능은 포유류와 달게 진행될 수 있다는 추정할 수 있었다. 한편, 세포내의 스핑고지질 대사계의 변화가 migration에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, So1P의 농도를 조절하는 효소, S1Pl yase 및 Sphk를 deletion 또는 overexpression한 안정된 F9 mutant 세포를 사용하여, So1P에 대한 주화성(chemotaxis)를 검토하였다. 그 결과, F9 세포는 So1P에 대한 농도의존적 주화성을 나타내며, 특히 S1P lyase deletion이 migration을 약간 억제하는 것처럼 나타나나, 상세한 기전은 검토중이다.
  • Research result and Utilization method
  • 4.1 Chicken배아 발생에서의 So1P

    - 유정란 배아 발생기간(3일 ~6일간)에 관찰한 So1P의 함량은 변화하지 않았다. So1P의 함량은 성체의 함량에 비하여 적었으며(data not shown), 이는 혈관 분포 및 성숙의 완결 정도와 혈관내의 혈액량에 따라 So1P의 함량이 좌우되지 않나 추정된다. 반면, So의 함량은 급격한 변화를 보였다. 즉, 3일~4일간의 배아 발생시기에 So의 함량은 발생 3일째 53.22±13.39 pmol/33 mg wet weight에서 발생 4일째 22.02±7.04 pmol/33 mg wet weight로 떨어졌다. 혈액 중에는 So을 인산화하여 So1P로 전환하는 Sphk 활성이 존재함이 알려져 왔으며, 따라서 So의 감소는 Sphk 활성의 변화에 의할 가능성을 검토하였다. Sphk 활성 측정은 자연계에 존재하지 않는 C17-sphingosine을 배아 분획에 가하여, 일정시간 후 생성되는 C17-sphingosine 1-phosphate를 측정하여 얻었다. 발생초기에 Sphk의 활성이 높은 시점과 So의 양이 급격히 줄어드는 것은 이 시기에 Sphk의 활성화에 의하여, So1P의 생성속도가 증가함을 알 수 있다. 그러나 So1P의 외견상 증가가 나타나지 않는 것은 배아의 body weight의 증가에 의한 것임을 알 수 있다. 따라서 Sphk의 초기 활성에 의하여 생성된 So1P가 새로운 혈관을 형성하는데 충분한 정도로 공급되는 것으로 생각할 수 있다.

    4.2 Mutant F9 cells에서의 So1P 감응성 migration

    - So1P의 세포내 농도를 조절하는 효소로서 sphingosine kinase(Sphk)와 sphingosine 1-phosphate lyase (S1P lyase)를 들 수 있다. Sphk는 So1P를 합성하는 효소로 TNF-a, IL-2, PDGF등 여러 receptor 경유 외부인자에 의하여 활성화 한다. 한편, S1P lyase는 So1P를 hexadecenal 과 phosphoethanolamine으로 완전 분해하여, 이들을 glycophospholipids의 생합성에 재이용하게 한다. 따라서 본 연구에서는 세포내부의 So1P 농도를 높일 수 있는 mutants, 즉 Sphk overexpression한 세포군(F9-9, F9-12 cells)과 S1p lyase deletion cells (F9-7, F9-12 cells)를 이용하여, So1P의 내부농도 변화에 따른 migration 정도를 관찰하였다.
    그 결과, F9-7과 F9-12 cells, 즉 S1P lyase가 deletion된 세포일수록 So1P에 대한 chemotaxis가 증가함을 알 수 있었다. 그러나 10% FBS (So1P 함유)를 사용한 경우와, So1P를 단독으로 처리한 경우와의 migration 정도에 재현성이 요구되어, 이 결과를 좀더 연구 중이다.

    4.3 mammalian embryo 발생과정에서의 So1P

    - CD1 mouse embryo를 시간별로 collect하여 배아발생과정에서의 So1P 및 body weight를 조사한 결과, body weight 증가추세와 So1P의 증가추세는 정확히 일치하였다. 이는 배아 body weight의 증가가 혈관분포와 비례한다는 것을 시사하는 결과이다. 그러나 혈관이 아직 발달하지 못한 시기, 즉 E8.5~E9.5 사이에서는 So1P의 량이 상대적으로 축적되어 있음을 알 수 있다. 이는 포유류의 경우, 배아발생과정에서 아마도 모체로부터 지속적인 혈액성분의 공급이 이루어지고 있을 가능성을 시사하고 있다.
    - 배아발생에 대한 So1P의 역할을 좀더 자세히 알아보기 위하여, 만일 발생과정중 So1P의 수용체에 해당하는 EDG 수용체가 결손되면, 이 결손을 극복하기 위하여 리간드인 So1P의 변화가 예상될 것이라는 가설을 세웠다. 이는 EDG수용체의 결손이 혈관내피세포의 migration억제와 특히 혈관 평활근세포가 원시혈관을 둘러싸는 과정이 결함이 생겨 결국 배아는 E12.5 이내에 사망한다는 최근에 결과에 의한 것이다.
    - 그 결과, EDG-1의 결손 마우스 배아의 발생시기 E10.5에서 관찰한 결과, EDG 수용체의 결손 여부와 관계없이 So1P의 혈중 레벨은 약 10 pmol/50 mg body weight정도로 일정하게 유지되고 있음을 알 수 있었다. 이는 수용체 발생과 리간드의 발생과정이 따로 독립적으로 일어나며 상호 보완적이 아님을 증명한 최초의 결과이다.
    마찬가지로, EDG1에 상보적인 역할을 담당하는 EDG5수용체의 결손에서도 So1P는 성체의 혈중농도에서 서로 유의성 있는 차이를 보이지 않았다. 따라서 포유류 개체발생과정에서 EDG수용체와 그 리간드인 So1P의 상호연관성은 독립적인 것임을 알 수 있었다.
    -본 연구를 통하여, 모체와 독립적인 유정란과 수용체 mutant mice embryo를 이용하여, 수용체와 리간드 발생과정은 상호 독립적임을 알 수 있었다. 앞으로, 이런 독립적인 이벤트가 어떤 기전으로 상호작용을 하여 혈관 혈성과정에 기여하는지 연구할 계획이다.

  • Index terms
  • Sphingosine 1-phosphate, angiogenesis, chemotaxis
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