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장기기억 형성기전의 이해: 연접 eEF1A-결합단백질의 동정
Reports NRF is supported by Research Projects( 장기기억 형성기전의 이해: 연접 eEF1A-결합단백질의 동정 | 2005 Year 신청요강 다운로드 PDF다운로드 | 문일수(동국대학교(경주캠퍼스)) ) data is submitted to the NRF Project Results
Researcher who has been awarded a research grant by Humanities and Social Studies Support Program of NRF has to submit an end product within 6 months(* depend on the form of business)
  • Researchers have entered the information directly to the NRF of Korea research support system
Project Number E00002
Year(selected) 2005 Year
the present condition of Project 종료
State of proposition 재단승인
Completion Date 2006년 08월 24일
Year type 결과보고
Year(final report) 2006년
Research Summary
  • Korean
  • 뇌에 기억이 각인되기 위하여는 뇌신경회로가 새로 생성되던가 기존의 신경회로가 더 강화되어야 한다. 이 과정에는 연접근처에서의 단백질합성이 필수적이다. 본인은 연접후세포막(연접후치밀질, PSD)에 단백질합성조절인자 eEF1A가 많이 존재함을 밝혔고, 이의 기능을 이해하고자 우선 eEF1A와 결합하는 단백질을 yeast two-hybrid 방법으로 조사한 결과 N-acetylglucosamine kinase(GlcNAc kinase, NAGK)가 가장 강하게 결합함을 알았다. 따라서 본 연구에서는 NAGK의 세포내 분포와 eEF1A와의 관계를 연구하였다. 먼저 eEF1A와 NAGK 단백질들이 서로 결합함을 co-immunoprecipitation 방법으로 확인하였다. 세포내 분포를 immmunocytochemistry 방법으로 조사한 결과 성숙한(DIV21) 흰쥐 해마신경세포에서 NAGK는 신경세포의 가지를 따라 퍼져 있었으며 punctate한 분포를 나타내었다. NAGK puncta는 eEF1A나 NR2B와는 overlap되지는 않았지만 서로 인접하는 양상을 나타내었다. 신경세포의 초기 형태적 분화단계에서는 eEF1A와 NAGK의 세포내 분포가 전반적으로 매우 유사하며 filopodia 및 growthcone 에서 서로 colocalize하는 punctae들이 흔히 발견되었다. 또한 eEF1A와 NAGK는 microtubule과 매우 유사한 분포를 나타내었고, actin과는 초기발생단계에서는 overlap 되었으나 성숙 후에는 overlap이 약하였다. vincristine으로 microtubule을 해리시킨 경우 microtubule paracrystal은 somatodendritic shaft에 random하게 흩어지던가, periphery 쪽으로 이동하였는데, 이 두 경우 모두에서 NAGK는 microtubule의 분포와 중복되는 경향을 나타내었다. microtubule을 회복시켰을 경우 NAGK의 분포가 다시 somatodendritic domain의 center 혹은 shaft로 돌아오는 것을 볼 수 있었다. 이러한 결과들은 NAGK와 micrutubule이 physical interaction을 하고 있음을 강력히 시사한다. 그러나 latrunculin으로 microfilament를 dissociation시켰을 경우 NAGK 분포에 큰 변화는 없었다. 이는 F-actin이 NAGK의 분포에 별다른 영향을 미치지 않음을 의미한다. 이상을 종합하면 eEF1A의 binding partner인 NAGK는 신경세포의 초기발생단계에서 membrane protrusion에 많이 표현되며 성숙한 경우에는 dendritic shaft에 고루 퍼지면서 spine neck에 돌출되는 양상을 보이고, 이러한 분포는 microtubule과의 상호작용에 의함을 시사한다. 아직까지 신경세포에서 NAGK의 기능에 대한 보고는 없다. 한편 eEF1A가 단백질합성인자이지만 이 본연의 기능 이외에 membrane 형태를 변화시키는 기능도 보고되고 있는바, 아마도 eEF1A와 NAGK는 신경의 형태발생에 있어 세포막의 형태적 변화에 관여할 것으로 예상된다.
  • English
  • In order to form long-term memories, it is necessary to strengthen existing neural circuits or to form new circuits, which require dendritic local protein synthesis. Previously, I identified eEF1A, a protein translation factor, in postsynaptic membrane (the postsynaptic density, PSD). Yeast two-hybrid selected N-acetylglucosamine kinase (GlcNAc kinase, NAGK) for eEF1A-binding partner. In this work, the interaction of eEF1A and NAGK was confirmed by co-immunoprecipitation. Whn DIV21 hippocampal neurons were immunostained with NAGK antiboy, NAGK immunopunctae were distributed throughout dendrites. The NAGK punctae did not overlap eEF1A or NR2B, but abut each other. In the early morphological development, both eEF1A and NAGK were highly expressed at the protrusion of cell membranes, such as filopodia and growthcone. Interestingly, the subcellular distribution of NAGK was very similar to that of microtubule. The expression of NAGK overlapped with actin in the early developmental stages but not in mature neurons. When microtubule was dissociated by vincristine, microtubule formed paracrystals which were disposed either randomly to somatodendritic shaft or periphery of the shaft. In either cases, NAGK followed microtubules. When microtubules were partially recovered, NAGK returned to normal distribution. However, there was no significant alteration in subcellular distribution when microfilaments were dissociated by latrunculin, indicating that microtubule regulates the distribution of NAGK. Taken together, these results suggest that eEF1A, in association with NAGK, have a role in changing membrane morphology such as in the formation of filopodia, growthcone, and dendritic spines.
Research result report
  • Abstract
  • 뇌에 기억이 각인되기 위하여는 뇌신경회로가 새로 생성되던가 기존의 신경회로가 더 강화되어야 한다. 이 과정에는 연접근처에서의 단백질합성이 필수적이다. 본인은 연접후세포막(연접후치밀질, PSD)에 단백질합성조절인자 eEF1A가 많이 존재함을 밝혔고, 이의 기능을 이해하고자 우선 eEF1A와 결합하는 단백질을 yeast two-hybrid 방법으로 조사한 결과 N-acetylglucosamine kinase(GlcNAc kinase, NAGK)가 가장 강하게 결합함을 알았다. 따라서 본 연구에서는 NAGK의 세포내 분포와 eEF1A와의 관계를 연구하였다.
    먼저 eEF1A와 NAGK 단백질들이 서로 결합함을 co-immunoprecipitation 방법으로 확인하였다. 세포내 분포를 immmunocytochemistry 방법으로 조사한 결과 성숙한(DIV21) 흰쥐 해마신경세포에서 NAGK는 신경세포의 가지를 따라 퍼져 있었으며 punctate한 분포를 나타내었다. NAGK puncta는 eEF1A나 NR2B와는 overlap되지는 않았지만 서로 인접하는 양상을 나타내었다. 신경세포의 초기 형태적 분화단계에서는 eEF1A와 NAGK의 세포내 분포가 전반적으로 매우 유사하며 filopodia 및 growthcone 에서 서로 colocalize하는 punctae들이 흔히 발견되었다.
    또한 eEF1A와 NAGK는 microtubule과 매우 유사한 분포를 나타내었고, actin과는 초기발생단계에서는 overlap 되었으나 성숙 후에는 overlap이 약하였다.
    vincristine으로 microtubule을 해리시킨 경우 microtubule paracrystal은 somatodendritic shaft에 random하게 흩어지던가, periphery 쪽으로 이동하였는데, 이 두 경우 모두에서 NAGK는 microtubule의 분포와 중복되는 경향을 나타내었다. microtubule을 회복시켰을 경우 NAGK의 분포가 다시 somatodendritic domain의 center 혹은 shaft로 돌아오는 것을 볼 수 있었다. 이러한 결과들은 NAGK와 micrutubule이 physical interaction을 하고 있음을 강력히 시사한다.
    그러나 latrunculin으로 microfilament를 dissociation시켰을 경우 NAGK 분포에 큰 변화는 없었다. 이는 F-actin이 NAGK의 분포에 별다른 영향을 미치지 않음을 의미한다.

    이상을 종합하면 eEF1A의 binding partner인 NAGK는 신경세포의 초기발생단계에서 membrane protrusion에 많이 표현되며 성숙한 경우에는 dendritic shaft에 고루 퍼지면서 spine neck에 돌출되는 양상을 보이고, 이러한 분포는 microtubule과의 상호작용에 의함을 시사한다. 아직까지 신경세포에서 NAGK의 기능에 대한 보고는 없다. 한편 eEF1A가 단백질합성인자이지만 이 본연의 기능 이외에 membrane 형태를 변화시키는 기능도 보고되고 있는바, 아마도 eEF1A와 NAGK는 신경의 형태발생에 있어 세포막의 형태적 변화에 관여할 것으로 예상된다.
  • Research result and Utilization method
  • 연구결과
    ◎ eEF1A와 N-Acetylglucosamine kinase(GlcNAc kinase, NAGK)의 관계
    Synaptic eEF1A의 기능을 연구하기 위하여 우선 eEF1A와 결합하는 단백질을 yeast two-hybrid 방법으로 조사한 결과 GlcNAc kinase가 가장 강하게 결합함을 알았다.
    Immunoblot 결과 GlcNAc kinase(NAGK)는 synaptosome 즉 연접에 존재함을 확인하였다. 그러나 PSD에는 거의 존재하지 않았다. 이 결과는 NAGK가 spine neck에는 존재할 가능성이 있으나 synaptic membrane 혹은 PSD에는 존재하지 않음을 의미한다.
    eEF1A의 표현을 synaptic marker인 NR2B와 비교하여 조사한 결과 NAGK는 신경세포의 가지를 따라 퍼져 있었으며 punctate한 분포를 나타내었다. NAGK puncta는 eEF1A나 NR2B와는 overlap되지는 않았지만 서로 인접하는 양상을 나타내었다.
    초기 신경세포의 분화단계에서 eEF1A와 NAGK의 세포내 분포가 전반적으로 매우 유사하며 filopodia 및 growthcone에서 서로 colocalize하는 punctae들이 흔히 발견되었다. 이는 NAGK와 eEF1A가 서로 밀접한 관련이 있음을 암시한다.
    ◎ N-Acetylglucosamine kinase와 tubulin과의 관계
    발생초기단계(stage 2)에서 NAGK punctae는 tubulin fiber를 따라 분포함을 알았다. Stage 4 신경세포 단계(dendritic outgrowth)에서도 NAGK의 표현은 전반적으로 tubulin의 표현과 일치하였으며, dendrite를 따라 형성된 punctae는 synaptic marker인 NR2B와 인접하며, tubulin fiber에서부터 가쪽으로 튀어나오는 양상을 보였다.
    성숙한 신경세포(DIV21)에서도 NAGK와 tubulin의 표현은 전반적으로 서로 매우 유사하였다. 그리고 NAGK와 인접하여 NR2B의 puncta들이 형성되고 있으며 이 puncta들은 tubulin fiber로부터 가장자리쪽으로 돌출되는 양상을 보이고 있다.
    ◎ N-Acetylglucosamine kinase와 actin과의 관계
    초기 발달단계에서는 표현이 서로 overlap되는 경우가 많았으며, 성숙한 후에는 서로 인접하였다.
    ◎ microtubule 해리가 NAGK의 세포내 분포에 미치는 영향
    vincristine을 5 µM 농도로 6시간 처리한 결과 microtubule이 해리되어 paracrystal을 형성함을 확인할 수 있었다. microtubule이 paracrystal로 변형된 경우 microtuble은 두 가지 다른 형태의 세포내 분포를 보였다. 하나는 paracrystal이 somatodendritic shaft에 random하게 흩어지는 경우이고, 다른 하나는 periphery 쪽으로 이동하는 경우였다. 두 경우 모두에서 NAGK는 microtubule의 분포와 중복되는 경향을 나타내었다. 이러한 결과들은 NAGK와 micrutubule이 physical interaction을 하고 있음을 강력히 시사한다.
    ◎ F-actin 훼손이 NAGK의 세포내 분포에 미치는 영향
    대부분의 microfilament를 해리되었지만 microtubule은 intact한 상태에서 NAGK의 분포를 조사한 결과 대조군에 비하여 약간 patchy한 양상을 띠기는 하나 큰 변화는 없었다. 이는 F-actin이 NAGK의 분포에 별다른 영향을 미치지 않음을 의미한다.
    ◎ Co-immunoprecipitation 방법에 의한 eEF1A/NAGK 결합의 확인
    eEF1A와 NAGK 단백질들이 서로 결합함을 co-IP 방법으로 확인하였다.
    ◎ NAGK의 expression clone 제작
    overexpression 실험을 통하여 NAGK의 기능을 알아보고자 GFP 및 DsRed를 tagging한 expression clone을 제작하였다(Fig. 12). clone들의 insert size가 예상된 크기를 갖는 것들을 선정하여 DNA sequencing한 결과 이들의 reading frame이 in-frame으로 insert 되었음을 확인하였다.

    - 활용방안
    본 연구결과는 신경세포에서 NAGK의 표현에 대한 최초의 보고이다. 따라서 향후 신경세포에서 NAGK의 기능에 대한 연구의 기폭제가 될 것으로 기대된다.
  • Index terms
  • 기억, 연접, 신경세포, N-acetylglucosamine kinase, immunocytochemistry
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