혈관간세포의 증식과 비대, 족세포 사멸은 당뇨병성 신증의 특징적 변화이며 고혈당에 의하여 생성이 증가되는 TGF-b1은 당뇨병성 신증 발생의 주요 원인인자이다. Integrin-b와 결합하는 ILK는 PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체를 형성하여 세포생존을 조절한다. 당뇨병성 신 ...

혈관간세포의 증식과 비대, 족세포 사멸은 당뇨병성 신증의 특징적 변화이며 고혈당에 의하여 생성이 증가되는 TGF-b1은 당뇨병성 신증 발생의 주요 원인인자이다. Integrin-b와 결합하는 ILK는 PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체를 형성하여 세포생존을 조절한다. 당뇨병성 신증의 발생기전을 이해하기 위하여 혈관간세포와 분화 족세포의 PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체에 대한 TGF-b1의 조절역할과 그 의의를 조사하였다. TGF-b1은 분화 족세포의 PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체 형성과 a-parvin의 인산화를 유의하게 억제시켰으나 ERK(P42/44)와 P38 인산화, caspase-3 활성을 유의하게 증가시켰다. ANK와 dnP38a 유전자가 도입된 adenovirus를 이용한 실험에서도 이와 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 이에 반하여 혈관간세포를 이용한 연구에서는 보다 복잡한 결과가 관찰되었다. 혈청이 함유되지 않은 조건에서 TGF-b1은 복합체 형성과 P38 단백질의 인산화를 증가시켰으나 caspase-3의 활성을 유의하게 감소시켰다. 1% 혈청이 함유된 조건에서 TGF-b1으로 24, 48, 72시간 동안 세포를 처치하였을 때, TGF-b1에 의한 복합체 형성은 24시간에서 증가, 48시간에서 감소, 72시간에서 회복되었다. 현저한 세포증식과 caspase-3 활성은 유사한 처치 시간(48 hras)에서 관찰되었으나 현저한 세포비대는 다른 시간(72 hrs)에서 관찰되었다. ERK, PKB/Akt, P27, P38 단백질의 인산화는 TGF-b1의 처치 시간에 따라 각각 다르게 관찰되었다. P27 발현의 세포내 분포는 48시간에서 가장 현저한 차이를 보여 핵 발현은 현저하게 증가한 반면에 세포질 발현은 유의하게 감소하였다. 이러한 결과는 당뇨병성 신증의 발생과 진행을 조절하는 세포기전을 이해할 수 있는 중요한 근거라 할 수 있다. 즉, 고혈당에 의하여 생성, 분비가 증가된 TGF-b1은 PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체 형성 변화를 매개하여 족세포의 사멸을 유도함으로써 단백뇨를 발생하게 하고 혈관간세포의 초기 증식과 사멸 그리고 후기의 비대를 유도함으로써 혈관간세포 섬유화를 통한 사구체 비대를 유도하는 것으로 생각할 수 있다.

Diabetic nephropathy (DN) is characterized by proliferation and hypertrophy of glomerular mesangial cells (GMCs) and cellular death of differentiated glomerular podocytes (DGPs). TGF-b1 increased under hyperglycemic condition is one of major causing f ...

Diabetic nephropathy (DN) is characterized by proliferation and hypertrophy of glomerular mesangial cells (GMCs) and cellular death of differentiated glomerular podocytes (DGPs). TGF-b1 increased under hyperglycemic condition is one of major causing factors for the development and progression of DN. ILK, which interacts with integrin-b, regulates the cell survival and apoptosis through PINCH-1-ILK-a-parvin complex formation. To understand cellular mechanism involved in the development of DN, regulatory role of TGF-b1 on the complex formation was examined in the GMCs and DGPs. In DGPs, TGF-b1 significantly decreased the complex formation and a-parvin phosphorylation, but dramatically increased the P38 phosphorylation and caspase-3 activity. Similar results to these were also observed in the experiments using ANK- and dnP38a-constructed adenovirus. In contrast, GMCs showed a complicated cellular response to TGF-b1. Under serum-free condition, TGF-b1 significantly increased the complex formation and P38 phosphorylation, but decreased obviously the caspase-3 activity. When GMCs were treated with TGF-b1 for 24, 48 and 72 hrs under 1% serum-contained condition, TGF-b1 increased the complex formation at 24 hrs, decreased at 48 hrs, and increased at 72 hrs again. TGF-b1 significantly increased the cellular proliferation and caspase-3 activity at 48 hrs, whereas cell hypertrophy was obviously increased at 72 hrs. TGF-b1-induced phosphorylation of ERK, PKB/Akt, P27 and P38 was differently observed dependent on incubation time. At 48 hrs, P27 was mainly expressed in the nuclei, but not in cytosol. These results may act as an important scientific evidence to understand the cellular mechanism involved in the development and progression of DN. Namely, TGF-b1 in DGPs induces a cell death through destruction of PINCH-1-ILK-a-parvin complex, and these may cause a proteinuria. TGF-b1-induced change of complex formation in GMCs incuces the cellular proliferation, apoptosis and hypertrophy, and these cellular responses may regulate the progression of glomerular fibrosis through mesangial hypertrophy.

혈관간세포의 증식과 세포외 기질단백질의 축적으로 인한 사구체 비대와 사구체 기저막으로부터 족세포의 탈락으로 인한 단백뇨 발생은 당뇨병성 신증의 특징적 변화이며 고혈당에 의하여 생성과 분비가 증가되는 TGF-b1은 당뇨병성 신증의 발생과 진행을 조절하는 주요 ...

혈관간세포의 증식과 세포외 기질단백질의 축적으로 인한 사구체 비대와 사구체 기저막으로부터 족세포의 탈락으로 인한 단백뇨 발생은 당뇨병성 신증의 특징적 변화이며 고혈당에 의하여 생성과 분비가 증가되는 TGF-b1은 당뇨병성 신증의 발생과 진행을 조절하는 주요 인자이다. Integrin-b와 결합하는 integrin-linked kinase(ILK)는 PINCH-1-ILK-a-parvin 단백질 복합체를 형성하여 세포성장과 세포사멸을 조절한다. 당뇨병성 신증의 발생기전을 이해하기 위하여 TGF-b1에 의한 혈관간세포와 족세포의 PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체 형성 변화가 이들 세포의 성장과 사멸에 미치는 영향을 조사하였다.
분화 족세포의 PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체는 미분화 족세포의 것 보다 현저하게 높게 나타났으며, 이러한 복합체 형성은 protein kinase C(PKC)에 의하여 매개되는 것으로 관찰되었다. TGF-b1은 PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체 형성과 a-parvin의 인산화를 유의하게 억제시켰다. 또한, TGF-b1은 ERK(P42/44)와 P38 단백질의 인산화와 caspase-3 활성을 유의하게 증가시켰다. 그러나 JNK, PKB/Akt의 발현에는 영향을 미치지 않았다. FLAG-tagged ANK/ILK(Ad-ANK)와 dnP38a 유전자가 도입된 adenovirus를 이용한 실험에서도 이와 유사한 결과를 얻을 수 있었다. ILK의 ANK domain over expression에 의한 PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체 형성 저해는 족세포의 cell spreading과 cell adhesion을 현저하게 억제하였다.
혈관간세포를 이용한 연구에서는 다음과 같은 결과를 얻었다. 혈청이 함유되지 않은 조건에서 TGF-b1은 PKC의 활성을 매개하여 PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체 형성과 P38 단백질의 인산화를 증가시켰으나 caspase-3의 활성을 유의하게 감소시켰다. 그러나 TGF-b1은 ERK, JNK, PKB/Akt 발현에는 영향을 미치지 않았다. Ad-ANK를 이용한 실험에서도 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 1% 혈청이 함유된 조건에서 세포를 TGF-b1으로 24, 48, 72시간 동안 처치하였을 때 다양한 세포반응을 관찰할 수 있었다. TGF-b1에 의한 PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체 형성은 24시간에서 증가, 48시간에서 감소, 72시간에서 회복되었다. 세포증식은 48시간에 현저한 증가하였다가 72시간에 유의하게 감소하였다. 세포비대는 72시간에 현저하게 증가하였다. Caspase-3 활성은 24, 48시간에 유의하게 증가하였다. ERK, PKB/Akt, P27, P38 단백질의 인산화는 TGF-b1의 처치 시간에 따라 각각 다르게 관찰되었다. TGF-b1에 의한 P27 발현의 세포내 분포는 48시간에서 현저한 차이를 보여 핵 발현은 현저하게 증가한 반면에 세포질 발현은 감소하였다.
이러한 결과는 당뇨병성 신증의 세포병리학적 변화를 이해할 수 있는 중요한 근거로 작용할 수 있다. 즉, 고혈당에 의하여 생성, 분비가 증가된 TGF-b1은 PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체 형성 변화를 매개하여 족세포의 사멸을 유도함으로써 단백뇨를 발생하게 하고 혈관간세포의 초기 증식과 사멸 그리고 후기의 비대를 유도함으로써 사구체 비대를 일으키는 것으로 생각할 수 있다. 이는 지금까지 알려져 있지 않은 새로운 발견으로써 당뇨병성 신증으로 인한 만성 혹은 말기 신부전의 발생기전을 이해할 수 있는 의의를 가진다.

I. 연구결과
☞분화 족세포를 이용한 연구(Serum-free condition):
1. PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체 발현은 미분화 족세포에서 보다 분화 족세포에서 높게 관찰되었으며, 이는 세포 성장과 밀접한 관련이 있었다.
2. TGF-b1은 protein kinase C(PKC)의 활성을 매개하여 ...

I. 연구결과
☞분화 족세포를 이용한 연구(Serum-free condition):
1. PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체 발현은 미분화 족세포에서 보다 분화 족세포에서 높게 관찰되었으며, 이는 세포 성장과 밀접한 관련이 있었다.
2. TGF-b1은 protein kinase C(PKC)의 활성을 매개하여 PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체 형성을 현저하게 감소시켰다.
3. TGF-b1에 PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체 형성 감소는 P38 단백질의 인산화와 caspase-3 활성을 증가시켜 세포 사멸을 유도하였으며, 이러한 결과는 ILK의 ANK domain에 의한 복합체 형성 저해에 의해서도 관찰되었다.
4. TGF-b1은 ERK, JNK, PKB/Akt 단백질의 인산화에는 영향을 미치지 않았다.
5. ANK domain에 의한 PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체 형성 저해는 cell spreading과 cell adhesion을 현저하게 감소시켜 세포 사멸을 유도하였다.
☞혈관간세포를 이용한 연구(Serum-free condition):
1. TGF-b1은 PINCH-1, ILK, a-parvin의 세포내 발현 분포를 변화시켰다.
2. TGF-b1은 PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체 형성을 현저하게 증가시켰다.
3. TGF-b1에 의한 PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체 형성 증가는 P38 단백질의 인산화를 현저하게 증가시킨 반면에 caspase-3 활성을 유의하게 감소시켰다.
4. ANK domain에 의한 PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체 형성 저해는 P38 단백질의 인산화와 caspase-3 활성을 현저하게 증가시켰으나 ERK, JNK, PKB/Akt, P27 단백질의 발현과 인산화에는 영향을 미치지 않았다.
5. Cre-Flox에 의한 ILK knock-out은 현저한 세포 사멸을 초래하였다.
☞혈관간세포를 이용한 연구(1% serum-contained condition):
1. 족세포에서 관찰되지 않은 b-parvin의 발현이 증명되었다.
2. TGF-b1은 RSU-1-PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체 형성을 처치 24시간에는 증가, 48시간에는 감소, 72시간에는 증가시켰다.
3. TGF-b1에 의한 세포증식은 처치 48시간에 현저하게 증가하였다가 72시간에 유의하게 감소, 세포비대는 처치 72시간에 유의하게 증가, caspase-3 활성은 처치 24시간과 48시간에 현저하게 증가하였다.
4. TGF-b1에 의한 ERK, JNK, PKB/Akt, P27, P38 단백질의 인산화는 단백질의 종류와 처치 시간에 따라 각각 다르게 관찰되었다.
5. TGF-b1에 의한 P27 발현의 세포내 분포는 처치 24시간에 현저한 차이를 보여 핵 발현은 현저하게 증가한 반면에 세포질 발현은 유의하게 감소하였다.
II. 연구결과의 활용
1. 고혈당이나 TGF-b1에 의한 혈관간세포의 세포증식, 세포사멸, 세포비대에 대하여 ILK-integrin-ganglioside의 조절기전을 규명하기 위한 연구에 활용.
2. Ganglioside가 RSU-1-PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체 형성에 미치는 영향 규명.
3. 고혈당에 의한 신장세포의 섬유화와 세포전이분화(transdifferentiation)에 대하여 RSU-1-PINCH-1-ILK-a-parvin 복합체의 조절기전 규명.