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https://www.krm.or.kr/krmts/link.html?dbGubun=SD&m201_id=10014152&local_id=10016729
인간 지방에서 추출한 기질 세포의 피부에 대한 항 노화 효과
Reports NRF is supported by Research Projects( 인간 지방에서 추출한 기질 세포의 피부에 대한 항 노화 효과 | 2007 Year 신청요강 다운로드 PDF다운로드 | 동은상(고려대학교) ) data is submitted to the NRF Project Results
Researcher who has been awarded a research grant by Humanities and Social Studies Support Program of NRF has to submit an end product within 6 months(* depend on the form of business)
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  • Researchers have entered the information directly to the NRF of Korea research support system
Project Number E00040
Year(selected) 2007 Year
the present condition of Project 종료
State of proposition 재단승인
Completion Date 2008년 05월 26일
Year type 결과보고
Year(final report) 2008년
Research Summary
  • Korean
  • Human skin ex-vivo organotypic culture를 이용하여 광-노화 모델을 개발 하였다. 실험의 첫 단계자외선에 노출 되지 않은 40-50대 5인의 백인 여성의 복부 성형술 후 남은 복부 피부를 대상으로 피하지방을 제거하고 피부편을 준비하여 DMEM을 배양액으로 이용 하여 피부편의 표피층이 잠기지 않도록 air-fluid level 을 유지하며 petri-dish에서 어떠한 성장 인자도 없이 인간의 피부가 12일 이상 체외배양이 가능하였다. 자외선의 투사량은 축적된 자외선(A,B,C일부 포함)이 표피 세포의 괴사는 일으키지 않으면서 손상을 일으키는 subcytotoxic한 수준이어야 하며 순차적인 조직분석을 통해 자외선 조사량을 결정하였으며 IL 1700 radiometer 와 SED 240 UVB 감지기로 광원의 8cm 하부에서 자외선 세기를 감지하였다. 60 x 15 mm2 의 petri dish 의 뚜껑을 열고 투사하며 피부에 대한 투사량의 선택은UVB ;1600 J/m2 UVA ; 254 J/m2로 하였다. 실험군은 6가지이다. (I 군 : 자외선 비 투사 + ASCs 비 투여 , II 군: 자외선 비 투사 + ASCs 공동 배양, III 군: 자외선 투사 (광-노화 모델) + ASCs 비 투여, IV 군: 자외선 투사 (광-노화 모델) + ASCs 공동 배양, V군 : 자외선 비투사 +ASCs 진피내 주사, VI군: 자외선 투사 (광-노화 모델) + ASCs 진피내 주사). ASCs는 피부 공여자의 복부 지방에서 추출한 것으로 passage 0의 것을 한 petri dish 당 200만 세포를 투여하였다. ASCs의 항-노화 효과의 판정을 위한 H&E 염색 및 anti-apoptotic 효과나 anti-replicative senesence 를 측정한 결과 ASCs 투여군에서 UVB 조사 후 표피 층에 apoptosis 가 적었으며 senescense 가 적음을 확인 할 수 있었다. Involucrin 을 이용한 immunohistochemical stain 에서도 배양 7일 후에 ASCs 투여군에서 differntiation 이 더 진전된 양상을 보였다. 콜라겐과 탄성 섬유의 대사에 중요한 활성 및 비 활성 MMP(matrix metalloproteinase) 2 및 9는 zymography 를 통해 ASCs 투여군에서 증가되어 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 ASCs 의 투여는 in vitro explated organotypic skin culture를 이용한 인간 피부의 광노화 모델에서 노화에 대한 anti-apototic and anti-senecent 효과를 일부 갖고 있으며 이는 세포에서 직 간접 적으로 분비되는 여러 성장 인자등에 의함을 일부 밝혀 낼 수 있었다
  • English
  • In the study presented here, we use the irradiation of sub-cytotoxic UVB to explanted skin culture with or without autologous ASCs co-culture, and investigate the histometric analysis and immunohistochemical assay for anti-apoptotic and anti-senescent effect of autologos ASCs on photo aging model.
    Groups were as follws;
    Group I: no irradiation , no ASCs
    Group II: no irradiation , with ASCs co-culture
    Group III: UV-B irradiation, no ASCs
    Group IV: UV-B irradiation, with ASCs co-culture
    Group V: no irradiation, with ASCs intradermal injection
    Group VII: UV-B irradiation with ASCs intradermal injection
    The results were: 1. Histometric analysis of pyknosis and parakeratosis. : The amount of epidermal necrosis using H&E stain was largest in group III , in group IV and in group VI. Parakeratosis was noticed in group IV , VI in early days and groupIII in later days. 2. BrdU and PCNA stain: BrdU uptake was increased in group II and other irradiated groups. And PCNA stain was increased in group III. After irradiation the proliferative activity of the dermal layer was increased and the same findings were noticed in group II. 3. Anti Apoptotic activity (Apoptaq@) of ASCs: Anti-apoptotic cells in epidermis were increased statistically in ASCs treated group IV, Vi than ASCs non treated group III. ASCs had anti-apoptotic effect in irradiated epidermis. 4. Replicative senescence detection: Replicative senescense in epidermis was greater in group III than in group IV and VI until day 5. Replicative senescence in papillary dermis was variable but certain aggregated stain was noticed in group III. ASCs had anti-senescent effect on irradiated epidermis and dermis. 6. Involucrin immunohistochemical satining
    The explanted skins were different after 7 days' culture with ASCs. The staining of involucrin showed much differentiated feature in ASCs treated group in day 7.
Research result report
  • Abstract
  • In vitro ‘광-노화 (photoaging)' 모델을 개발하고 여기에 다양한 성장 인자를 직 간접으로 분비할 수 있는 것으로 밝혀진 성체 줄기 세포의 일종인 지방에서 추출한 기질 세포(adipose derived stromal cells; ASCs)를 공동 배양하여 광노화 모델에서 세포 치료적 효용에 대한 연구를 하였다. 백인의 복부 피부에서 균일게 여러 조각의 피부를 채취하여 배양하며 성장인자가 포함되지은 동일한 배양액을 이용하여 다음의 6개의 군으로 나누어 실험하였다 (Group I: skin ex-vivo culture, Group II: skin + ASCs (co-culture), Group III: skin + irradiation, Group IV:skin + irradiation + ASCs(co-culture), Group V: skin +ASCs intradermal injection, Group VI: skin + irradiation+ ASCs intradermal injection). ASCs 는 동일인의 지방을 이용하여 passage 0 의 것을 이용하였으며 60 x 15 mm3 의 petri dish 에 200만 개의 세포를 투여하였다. 광노화 모델의 histometric analysis에서 적절한 방사선 투여량을 결정하여 방사선조사의 양은 IL-1700기계를 이용하여 UVB ;1600 J/m2 UVA ; 254 J/m2 가 되게 하였다.
    ASCs의 항-노화 효과의 판정을 위한 H&E 염색 및 anti-apoptotic 효과나 anti-replicative senesence 를 측정한 결과 ASCs 투여군에서 UVB 조사 후 표피 층에 apoptosis 가 적었으며 senescense 가 적음을 확인 할 수 있었다. 또한 BrdU 와 PCNA 를 이용한 immunohistochemical assay 에서도 ASCs 투여군에서 표피의 basal layer에서 증식이 활발함을 발견하였다. Involucrin 을 이용한 immunohistochemical stain 에서도 배양 7일 후에 ASCs 투여군에서 differntiation 이 더 진전된 양상을 보였다. 콜라겐과 탄성 섬유의 대사에 중요한 활성 및 비 활성 MMP(matrix metalloproteinase) 2 및 9는 zymography 를 통해 ASCs 투여군에서 증가되어 있음을 확인할 수 있었다.
    따라서 ASCs 의 투여는 in vitro explated organotypic skin culture를 이용한 인간 피부의 광노화 모델에서 노화에 대한 anti-apototic and anti-senecent 효과를 일부 갖고 있으며 이는 세포에서 직 간접 적으로 분비되는 여러 성장 인자등에 의함을 일부 밝혀 낼 수 있었다.
  • Research result and Utilization method
  • 인간 피부의 in vitro 광 노화모델에서 배양 14일 까지 피부 부속기를 유지하는 건전한 모델을 개발할 수 있었다. AScs 의 항 노화 효과 검증을 위한 Histometric analysis는 H&E staining 을 이용하여 necrotic or pyknotic area와 parakeratosis 를 표준화된 사진 촬영 후 photoshop 을 이용하여 군간의 차이를 비교하였다. Verhoeff's staining 으로 elastic fiber (oxytalan fiber)를 관찰한 결과 ASCs 투여군에서 표피의 괴사가 적었으며 표피가 더 differentiation 된 양상을 보였으며 elastic fiber 도 더 증가된 양상을 보였다.
    Replicative senescence 와 apoptosis study를 위해 TUNEL asssay 로apoptosis 를 측정한 결과 ASCs 투여군에서 그 양이 적었으며 replicative senescence를 측정하기위한 SA β-Gal at pH 6.0 에서도 ASCs 투여군에서 그양이 적었다. epidermal basal layer의 증식능을 측정하기위한 BrdU 와 PCNA 염색에서도 ASCs 투여군에서 증식능이 높았다. 표피의 differentiation 정도를 보기위한 Involucrin immunohistochemical stain 에서는 ASCs 투여군에서 배양 3일째와 비교하여 7일째의 표피의 differentiation 이 진행된 것을 발견하였다.
    ASCs는 인간피부의 광노화 모델에서 항노화 효과이외에 표피의 분화와 증식에도 일부분 관여하는 것으로 보이며 이의 증명을 위한 후속 연구가 진행중이다. 위의 검증을 위해서는 in vivo 실험이 필요하며 현재 임상에서 많이 쓰여지는 지방 이식외에 culture 하지 않은 ASCs (passage 0)를 이용한 피부에 대한 임상실험도 병행함이 의의가 있을 것이다.
  • Index terms
  • 체외 피부 배양, 인간, 재건 피부, 지방, 기질세포, 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 세포 치료, 자외선, 노화, 항-노화, 노쇠
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