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효소 O-GlcNAcase의 카르복시 말단에 존재하는 N-acetyltransferae 영역의 기능분석
Reports NRF is supported by Research Projects( 효소 O-GlcNAcase의 카르복시 말단에 존재하는 N-acetyltransferae 영역의 기능분석 | 2008 Year 신청요강 다운로드 PDF다운로드 | 강대욱(창원대학교) ) data is submitted to the NRF Project Results
Researcher who has been awarded a research grant by Humanities and Social Studies Support Program of NRF has to submit an end product within 6 months(* depend on the form of business)
  • Researchers have entered the information directly to the NRF of Korea research support system
Project Number C00048
Year(selected) 2008 Year
the present condition of Project 종료
State of proposition 재단승인
Completion Date 2009년 11월 30일
Year type 결과보고
Year(final report) 2009년
Research Summary
  • Korean
  • 효소 O-linked N-acetyl-β-D glucosaminidase (O-GlcNAcase) 는 O-GlcNAc으로 변형된 단백질에서 N-acetylglucosamine을 제거한다. O-GlcNAcase에는 hyaluronidase domain과 N-acetyltransferase domain의 두 영역이 존재한다. 효소의 촉매활서에 중요한 부위를 명확히 하깅 위해 13종의 point mutant, 4종의 internal deletion, 1종의 아미노말단 삭제 변이주 및 카르복시 말단의 220 아미노산까지 순차적인 삭제 변이주 7종을 제조하여 분석한 결과 hyaluronidase, N-acetyltransferase 영역 및 internal deletion 변이주에서는 효소활성이 나타나지 않았으나 55개의 아미노 말단의 55개 아미노산과 카르복시 말단의 순차적인 삭제는 활성이 약 반 정도 유지하였다. 이러한 결과로부터 hyaluronidase 영역은 효소의 촉매활성에, N-acetyltransferase domain은 조절기능에 관여하는 것으로 가정된다. N-Acetyltransferse domain의 기능을 밝히기 위한 일환으로 O-GlcNAcase와 상호작용하는 단백질을 사람 뇌의 cDNA library에서 탐색하였다. MGEA5 유전자를 함유한 bait vector pGBKT7으로 형질전환된 S. cerevisiae AH109와 사람의 뇌 cDNA library로 형질전환된 S. cerevisiae Y187과 mating을 하고 선택배지에서 푸른색을 나타내는 81 클론을 선별하였다. 이 중 β-galactosidase 활성이 높은 10 클론을 재선별하고 염기서열의 부분분석으로 S-adenosyl homocysteine hydrolase, growth arrest-specific 7 isoform c and glycine- glutamate- thienylcyclohexylpiperidine-binding protein 등 세 단백질을 확인하였고 전체 염기서열분석이 가능한 2번 클론은 사람의 S-adenosyl homocysteine hydrolase와 99% 상동성을 나타내었으며 이 다백질은 O-GlcNAcase의 hyaluronidase domain에 결합함을 증명하였다. 현재 이 단백질의 기능을 밝히기 위한 보완실험을 진행 중이다.
  • English
  • Protein glycosylation by O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) is ubiquitous in many eukaryotic nuclear and cytosolic proteins. This phenomena occurs very dynamically and serves as signaling and regulatory functions analogous to phosphorylation. The enzyme, O-linked N-acetyl-β-D glucosaminidase (O-GlcNAcase) encoded by MGEA5 gene catalyzes the cleavage of N-acetylglucosamine from O-GlcNAcylated proteins. It is one of key enzymes in the post-translational modification of intracellular proteins by O-GlcNAc. Two forms of human O-GlcNAcase gene were cloned and expressed as fusion proteins in Escherichia coli. The O-GlcNAcase has two conserved domains, amino terminal hyaluronidase-like domain and carboxy terminal N-acetyltransferase domain. Extensive point mutagenesis and deletion studies were done to define catalytically important domains. The deletions of hyaluronidase-like domain, N-acetyltransferase domain and internal regions abolished enzyme activity. But, N-nerminal 55 amino acid deletion and C-terminal truncation showed lower activity. Based on deletion analysis and point mutagenesis, we suggest that hyaluronidase-like domain is essential for enzyme activity and carboxy terminal N-acetyltransferase domain may be modulatory function. As an effort to reveal the function of N-acetyltransferase domain and to identify the O-GlcNAcase-interacting proteins, we screened a human brain cDNA library using yeast two-hybrid system. The MGEA5 gene was cloned into a bait plasmid, pGBKT7 and was transformed into Saccharomyces cerevisiae AH109. Then, the transformants were mated with S. cerevisiae Y187 pre-transformed with human brain cDNA library. 81 positive clones showing blue colonies were primarily selected on SD(-Trp-Leu-Ade-His)/X-α-Gal agar plates. Finally, we chose 10 clones with high β-galactosidase activity for further analysis. The plasmid DNAs were isolated and nucleotide sequences were analyzed. The partial nucleotide sequencing and blast search suggested screened cDNAs encode presumable S-adenosyl homocysteine hydrolase, growth arrest-specific 7 isoform c and glycine- glutamate- thienylcyclohexylpiperidine-binding protein. Yeast two-hybrid system revealed S-adenosyl homocysteine hydrolase interacted with N-terminal catalytic domain and the others with C-terminal N-acetyl-transferase domain of O-GlcNAcase. For more correct assignment of screened proteins, we performed full nucleotide sequencing by primer walking. Based on Blast search, clone 2 encode human SAHH with 99% identity.
Research result report
  • Abstract
  • 진핵세포의 핵과 세포질 단백질의 아미노산 세린이나 쓰레오닌의 수산기에 O-linked N-acetylglucosamin(O-GlcNAc)이 결합하는 새로운 유형의 당쇄는 1984년에 처음으로 발견된 이후로 수백종의 세포 내 단백질이 O-GlcNAc에 의해 변형됨이 보고되었으며 이러한 당쇄는 분비성 및 막 단백질에서 일어나는 고전적인 당쇄와는 차이점을 나타낸다. 첫째, 한 분자의 acetylglucosamin 만이 단백질에 부착되며, 둘째 O-GlcNAc 당쇄의 반감기가 아주 짧은 dynamic process로서 세포 내 신호전달과 조절기능을 수행한다. 비정상적인 O-GlcNAc 당쇄는 암, 당뇨병 및 티행성 신경질환 등과 관련이 있는 것으로 보고되었다. 세포 내 O-GlcNAc 수준은 O-GlcNAc 을 단백질에 부착시키는 OGT와 반대로 이것을 떼어내는 O-GlcNAcase의 두 효소에 의해 조절된다. 효소 O-GlcNacase는 아미노산 잔기가 916개인 형태와 677개인 변이체(v-O-GlcNAcase) 의 두 가지가 알려져 있다. 두 효소는 O-GlcNAcase가 N-acetyltransferase와 상동성을 보이는 영역이 추가로 존재하는데 이영역의 기능은 밝혀지지 않은 상태이다. NCBI의 Blast 검색을 한 결과 O-GlcNAcase에는 아미노 말단의 hyaluronidase domain과 카르복시 말단의 N-acetyltransferase domain 등 두 개의 conserved domain이 존재하였다. 본 연구에서는 O-GlcNAcase 유전자의 internal deletion, N-terminal deletion, C-terminal truncation 및 point mutation 등을 통해 아미노 말단의 hyaluronidase domain은 효소의 촉매작용에 필요한 영역이고 카르복시 말단의 N-acetyltransferase domain은 기질의 결합과 같은 조절기능을 수행할 것으로 보인다. Yeast two-hybrid system을 이용하여 사람의 뇌 cDNA에서 O-GlcNAcase와 상호작용하는 10개의 클론을 선별하고 염기서열분석을 통해 사람의 homocysteine hydrolase를 최종적으로 탐색하였다. 이 단백질의 세포 내 역할을 밝히고 있는 중이다.
  • Research result and Utilization method
  • 대장균에서 재조합 O-GlcNAcase 생산계를 확립하여 생화학적 연구에 필요한 효소의 공급을 원활하게 할 수가 있다. 기질 유사체인 p-nitrophenyl-GlcNAce(pNP-GlcNAc-)을 이용하여 in vitro 효소활성 측정법을 확립하였다. Hyalurinidase domain, 두 영역사이의 deletion 2종, N-acetyltransferase domain의 일부분을 포함하는 영역의 deletion mutant, hyaluronidase 영역의 바깥 쪽의 5'말단 삭제 변이주, N-acetyltransferase 영역의 truncation mutant는 150개의 아미노산 잔기가 제거될 때까지는 급격한 활성의 감소는 없었으나 특이하게도 220 개의 나미노산이 제거된 변이체는 야생형 효소에 비해 4배의 활성을 보유하였다.이 근처에 regulatory sequence의 존재의 확인을 요한다. S. cerevisiea AH109 pGBKT7/MGEA5 형질전환체를 인간 뇌 유래 cDNA library가 pre-transformation된 S. cerevisiae Y187과 mating 하고 배양한 후 배양액을 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal agar plate에 도말한 결과 81개의 파란색 집락을 탐색할 수 있었다. 이중 푸른색이 강한 10개의 클론을 선별하여 YPD 액체배지에 접종하고 배양하여 회수한 세포의 β-galactosidase 효소활성을 측정한 결과 a,d,f,g 네 클론의 색깔이 상대적으로 강하였다. 탐색한 cDNA의 부분 염기서열을 분석하여 NCBI Blast 검색을 하여 네 가지의 단백질을 추정하고 염기서열분석을 끝까지 실시하여 클론 2(f, g)번이 S-adenosylhomocysteine hydrolase임을 확인하였다. 이 단백질은 O-GlcNAcase의 N-acetyltransferase domain과 결합함을 증명하였다. 따라서 아미노산 대사와 O-GlvNAc 변형과의 관련성을 연구하는 중요한 단서가 될 것으로 보이며 이 단백질의 세포 내 기능을 밝히기 위해 생화학적,세포생물학적 관점에서 보충 연구를 진행하고 있다. 본 연구에서 탐색한 SAHH이 OGT에 의해 당쇄가 되는지를 밝히고 아미노산 대사와 O-GlcNAc 변형의 관련성을 구명할 계획이다. 또한 신호전달, apoptosis, 전사, 번역 등 세포 내 여러 현상을 이해하고 해석하는데 새로운 표지 분자로 사용될 가능성이 있을 것이다. SAHH의 결핍으로 초래되는 아미노산 Met 대사의 유전적 장애와 O-GlcNAc 변형과의 관련성도 관심사가 될 것으로 본다.
  • Index terms
  • O-GlcNAc, 당쇄, OGT, O-GlcNAcase, deletion mutant, point mutant, hyaluronidase domain, N-acetyltransferase domain, yeast two-hybrid system,
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