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https://www.krm.or.kr/krmts/link.html?dbGubun=SD&m201_id=10006990&local_id=10011718
비소가 혈소판의 응고 촉진 작용 및 혈소판의 부착 단백 발현에 미치는 영향 (Effect of arsenic procoagulant activity and adhesion molecule expression of platelets)
Researcher who has been awarded a research grant by Humanities and Social Studies Support Program of NRF has to submit an end product within 6 months(* depend on the form of business)
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  • Researchers have entered the information directly to the NRF of Korea research support system
Project Number E00015
Year(selected) 2004 Year
the present condition of Project 종료
State of proposition 재단승인
Completion Date 2006년 04월 25일
Year type 결과보고
Year(final report) 2006년
Research Summary
  • Korean
  • 주로 음용수에의 오염을 통해 인체에 노출되는 비소는 다양한 생체 내 효과를 유발하여, 최근 큰 주목을 받고 있다. 음용수 중의 비소 오염과 그로 인한 여러 질환의 발병은 대만, 인도, 방글라데시 및 아르헨티나, 미국 등에서 전 세계적으로 보고되고 있으며, 미국 환경부와 세계 보건 기구 등에서 음용수 중 비소를 10 ppb 이하로 규제하기 위해 여러 가지 노력을 기울이고 있다. 반면, 우리 나라의 규제치는 50 ppb로 규정되어 있으며, 비소 오염 실태 및 그 영향에 대한 연구가 미미한 실정이다. 만성적인 비소의 노출이 유발하는 생체 내 효과는 매우 다양하지만, 특히 심각한 심혈관계 질환 (cardiovascular disease; CVD)을 유발한다는 사실이 많은 역학 조사에서 보고되고 있다. 만성적인 비소의 노출이 심혈관 질환을 유발하는 기전에 대해서는 혈관 내피 세포와 평활근 세포, 그리고 혈소판 등을 대상으로 여러 연구가 진행되고 있으나, 아직까지 명확한 기전은 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 혈전 생성 및 다양한 심혈관 질환의 발병에 기여하는 혈소판을 대상으로 하여 비소가 혈소판과 인접 조직과의 상호 작용에 영향을 주는지 확인함으로써, 만성적인 비소 노출 집단에서 발견되는 심혈관 질환 발병의 한 원인을 제시하고자 하였다. 혈소판과 인접 조직과의 상호 작용은 효율적인 혈액 응고에 기여하는 혈소판의 혈액 응고 촉진 활성 (procoagulant activity)과, 부착 단백 발현 (adhesion molecule expression)을 통한 혈소판-혈관 내피 세포 부착의 두 측면에서 연구되었다. 정상 상태에서 세포막 안쪽에 존재하는 phosphatidylserine (PS)은 혈소판 활성화 시에 세포막 바깥쪽으로 노출되며, 노출된 PS는 coagulation cascade 중의 tenase complex와 prothrombinase complex의 반응 장소를 제공하여, 혈액 응고계의 최종 산물인 thrombin의 생성을 촉진함으로써 효율적인 혈액 응고를 가능하게 한다. 또한, 혈소판 활성화 시에 생성, 분비되는 직경 1 m 이하의 microparticle (MP)은 혈소판 세포막의 변형을 초래하여 PS 노출을 유발할 뿐만 아니라, 그 외부에 직접 PS를 노출시키고 있어 혈류 내에서의 혈액 응고를 촉진할 수 있다. 이렇듯, 혈소판의 PS 및 MP를 매개로 하여 혈액 응고계의 효율적인 활성화가 촉진되는데, 이를 혈소판의 혈액 응고 촉진 활성이라 한다. 또한, 혈소판은 혈액 내 세포 및 혈관계의 혈관 내피 세포와 작용함으로써 혈전 생성능을 증가시킬 수 있다. 혈소판과 인접 조직과의 이러한 부착 작용은 혈소판 표면으로 발현된 부착 단백 (adhesion molecule)에 의해 매개되며, 대표적인 부착 단백으로는 glycoprotein (GP) Ib/IX/V, GP IIb/IIIa, P-selectin 등이 있다. 이들의 발현 정도가 변화되어 혈소판과 인접 세포와의 부착이 유발되며, 특히 GP IIb/IIIa를 매개로 한 혈소판과 혈관 내피 세포와의 부착은 효율적인 지혈 과정에 참여함이 알려져 있다.
    분리된 사람의 혈소판에 무기 비소 (arsenite; AsIII)를 노출시킨 후, 생체 내 혈소판 활성 물질인 thrombin을 가하여 혈소판 활성화를 유도하였다. Arsenite는 세포 외막으로의 PS 노출 및 혈소판 유래의 MP 생성을 촉진시킴으로써, 농도 및 시간 의존적으로 혈소판의 혈액 응고 촉진 활성을 유도하였다. 비소의 효과는 세포 내 calcium 증가와 calcium 의존적 단백 효소인 calpain의 활성화에 의해 매개되었으며, 세포막 비대칭성을 조절하는 주요 효소인 flippase 또한 비소 처리에 의해 억제되었다. 혈액 응고계에 대한 혈소판의 작용과 더불어 혈소판의 부착 단백 발현에 주는 비소의 영향을 확인한 결과, 비소의 노출은 혈소판의 부착 단백인 GP Ib/IX/V, GP IIb/IIIa, 그리고 P-selectin의 세포막 발현을 조절하는 것으로 나타났다. 이러한 in vitro 효과는 음용수 중 비소 노출과 복강 내 비소 투여를 통한 in vivo 동물 실험에서도 확인되어, 비소 노출에 의해 혈소판의 PS 노출 및 부착 단백 발현이 증폭되었다. 결론적으로, 비소 노출은 혈소판의 PS 노출과 MP 생성을 매개로 혈소판의 혈액 응고 촉진 작용을 증폭시켜 효율적인 혈액 응고를 유도하며, 부착 단백 발현을 조절하였다. 이러한 실험 결과를 종합하여 볼 때, 본 연구의 밝힌 비소에 의한 혈소판의 혈액 응고 촉진 활성 및 부착 단백 발현 조절을 통한 혈소판과 인접 조직과의 상호 작용 증가는 만성적인 비소 노출 집단에서 보고되는 심혈관 질환 (CVD)의 한 가지 원인이 될 수 있을 것으로 사료된다.
  • English
  • Many epidemiological studies reported that there are strong correlations between arsenic in drinking water and occurrences of cardiovascular diseases (CVD), but the exact mechanism has not been clearly suggested yet. We investigated if arsenic can affect the interactions of platelets with other tissues, which are essential for effective blood clotting, thrombus formation and progression of CVD. Interaction of platelets with coagulation system is mediated by procoagulant activity of platelets through phosphatidylserine (PS) exposure and microparticle (MP) generations, providing a site for an assambly of coagulation enzymes. In addition, the adhesion of platelets to endothelial cells via adhesion molecules contributes to development of thrombus formation. So, we investigated the effects of arsenic on platelet procoagulant activity and adhesion molecule expressions. Arsenite (trivalent inorganic arsenic) significantly enhanced thrombin-induced procoagulant activity of human platelets in a concentration- and time-dependent manner as observed in a prothrombinase assay. In flow cytometric analysis, we found that arsenite enhanced PS exposure and MP formation. These effects of arsenite appeared to be mediated by enhanced calcium increase and activation of calpain. In addition, arsenite inhibited flippase, suggesting exposed PS could be maintained in outer membranes. Next, we evaluated the effects of arsenic on adhesion molecule expression, another event mediating the interaction of platelets to tissues. Arsenite potentiate thrombin-induced activation of glycoprotein (GP) IIb/IIIa, decrease of GP Ib/IX/V and expression of P-selection in human platelets. In vivo studies after exposure of arsenite via i.p. administration and drinking water revealed PS exposure as well as P-selectin expression was increased. Moreover, arsenite infusion led to the increase of thrombus formation in in vivo venous thrombosis rat model. In conclusion, arsenite and its trivalent metabolites enhanced procoagulant activity of platelets through PS exposure and increased platelet adhesion to endothelial cells through adhesion molecule expressions, leading to increase of thrombus formation. Increased interactions of platelets with coagulation systems and endothelial cells could be major contributing factors in CVD associated with chronic exposure of arsenic by drinking water.
Research result report
  • Abstract
  • 비소는 환경 중에 널리 존재하는 원소로서, 주로 비소에 오염된 음용수를 통해 인체에 노출된다. 음용수 중의 비소 오염과 그로 인한 여러 질환의 발병은 대만, 인도, 방글라데시 및 아르헨티나, 미국 등에서 전 세계적으로 보고되고 있으며, 미국 환경부와 세계 보건 기구 등에서 음용수 중 비소를 규제하려는 움직임도 활발하다. 만성적인 비소의 노출이 유발하는 생체 내 효과는 매우 다양하며, 특히 여러 심혈관계 질환 (cardiovascular disease; CVD)을 유발한다는 사실이 많은 역학 조사에서 보고되고 있다. 만성적인 비소의 노출이 심혈관 질환을 유발하는 기전에 대해서는 혈관 내피 세포와 평활근 세포, 그리고 혈소판 등을 대상으로 여러 연구가 진행되고 있으나, 아직까지 명확한 기전은 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 혈전 생성 및 다양한 심혈관 질환의 발병에 기여하는 혈소판을 대상으로 하여 비소가 혈소판과 인접 조직과의 상호 작용에 영향을 주는지 확인함으로써, 만성적인 비소 노출 집단에서 발견되는 심혈관 질환 발병의 한 원인을 제시하고자 하였다. 혈소판과 인접 조직과의 상호 작용은 효율적인 혈액 응고에 기여하는 혈소판의 혈액 응고 촉진 활성 (procoagulant activity)과, 부착 단백 발현 (adhesion molecule expression)을 통한 혈소판-혈관 내피 세포 부착의 두 측면에서 연구되었다. 정상 상태에서 혈소판의 세포막 안쪽에 존재하는 phosphatidylserine (PS)은 혈소판 활성화 시에 세포막 바깥쪽으로 노출되며, 노출된 PS는 coagulation cascade 중의 tenase complex와 prothrombinase complex의 반응 장소를 제공하여, 혈액 응고계의 최종 산물인 thrombin의 생성을 촉진함으로써 효율적인 혈액 응고를 가능하게 한다. 또한, 혈소판 활성화 시에 생성, 분비되는 직경 1 um 이하의 microparticle (MP)은 혈소판 세포막의 변형을 초래하여 PS 노출을 유발할 뿐만 아니라, 그 외부에 직접 PS를 노출시키고 있어 혈류 내에서의 혈액 응고를 촉진할 수 있다. 이렇듯, 혈소판의 PS 및 MP를 매개로 하여 혈액 응고계의 효율적인 활성화가 촉진되는데, 이를 혈소판의 혈액 응고 촉진 활성이라 한다. 분리된 사람의 혈소판에 무기 비소 (arsenite; AsIII)를 노출시킨 후, 생체 내 혈소판 활성 물질인 thrombin을 가하여 혈소판 활성화를 유도하였다. Arsenite는 세포 외막으로의 PS 노출 및 혈소판 유래의 MP 생성을 촉진시킴으로써, 농도 및 시간 의존적으로 혈소판의 혈액 응고 촉진 활성을 유도하였다. 비소의 효과는 세포 내 calcium 증가와 calcium 의존적 단백 효소인 calpain의 활성화에 의해 매개되었으며, 세포막 비대칭성을 조절하는 주요 효소인 flippase 또한 비소 처리에 의해 억제되었다. 혈액 응고계에 대한 혈소판의 작용과 더불어, 혈관 내피 세포와 혈소판의 상호 작용에 비소 (arsenite)가 주는 영향을 파악하기 위하여 혈소판의 부착 단백 발현에 주는 비소의 영향을 확인하였다. 혈소판은 혈액 내 세포 및 혈관계의 혈관 내피 세포와 작용함으로써 혈전 생성능을 증가시킬 수 있다. 혈소판과 인접 조직과의 이러한 부착 작용은 혈소판 표면으로 발현된 부착 단백 (adhesion molecule)에 의해 매개되며, 대표적인 부착 단백으로는 glycoprotein (GP) Ib/IX/V, GP IIb/IIIa, P-selectin 등이 있다. 이들의 발현 정도가 변화되어 혈소판과 인접 세포와의 부착이 유발되며, 특히 GP IIb/IIIa를 매개로 한 혈소판과 혈관 내피 세포와의 부착은 효율적인 지혈 과정에 참여함이 알려져 있다. 실험 결과, 비소의 노출은 혈소판의 부착 단백인 GP Ib/IX/V, GP IIb/IIIa, 그리고 P-selectin의 세포막 발현을 조절하는 것으로 나타났다. 이러한 in vitro 효과는 음용수 중 비소 노출과 복강 내 비소 투여를 통한 in vivo 동물 실험에서도 확인되어, 비소 노출에 의해 혈소판의 PS 노출 및 부착 단백 발현이 증폭되었다. 결론적으로, 비소 노출은 혈소판의 PS 노출과 MP 생성을 매개로 혈소판의 혈액 응고 촉진 작용을 증폭시켜 효율적인 혈액 응고를 유도하며, 부착 단백 발현을 조절하였다. 혈소판의 PS 노출 및 MP 생성을 통한 혈액 응고 촉진 활성과, 부착 단백 발현을 통한 인접 세포에의 부착이 다양한 심혈관 질환의 발병 및 진전에 관여함을 고려할 때, 본 연구의 밝힌 비소에 의한 혈소판과 인접 조직과의 상호 작용 증가 효과는 만성적인 비소 노출 집단에서 보고되는 심혈관 질환 (CVD)의 한 가지 원인으로 제시될 수 있을 것이다.
  • Research result and Utilization method
  • 본 연구에서 음용수 중의 주 오염 형태인 +3가 무기 비소 (arsenite)는 혈소판의 활성화를 촉진하여, 혈소판 혈액 응고 촉진 활성에 기여하는 phosphatidylserine (PS)의 노출 및 microparticle (MP)생성을 증가시켰다. 이러한 현상은 혈소판 내 calcium 증가의 증폭과, calcium 의존적인 단백 효소인 calpain에 의해 매개되는 것으로 나타났으며, 세포막의 지질 분포에 관여하는 flippase를 억제하는 효과도 파악되었다. 또한, arsenite는 혈소판의 부착 단백인 GP IIb/IIIa, GP Ib/IX/V, P-selectin의 발현 정도를 조절하여, 혈소판과 인접 세포와의 부착을 촉진시킬 수 있는 것으로 확인되었다.
    본 연구에서 시험한 무기 비소는 음용수 중의 오염을 통하여 주로 노출되는 중금속으로, 최근, 미국을 비롯하여 중국, 인도, 대만, 아르헨티나 등에서 비소 오염으로 유발되는 다양한 증상들이 보고되며 큰 주목을 받고 있다. 이에 세계 보건 기구와 미국 환경부에서는 비소의 음용수 중 규제치를 10 ppb로 규정하여 집중 관리하고 있으며, 규제치를 낮추어야 한다는 주장도 제기되고 있다. 반면 우리나라의 규제치는 50 ppb로 규정되어 있으며, 실제 비소 오염 실태 및 그 증상은 깊이 연구되지 않는 실정이다. 본 연구에서는 비소가 유발하는 생체 내 효과를 밝히고자 하며, 이러한 연구를 통해 비소 오염의 심각성을 알림으로써, 우리나라의 비소 규제 및 비소 오염에 대한 연구에 방향을 제시할 것으로 생각된다.
    또한, 본 연구에서는 비소의 다양한 생체 효과 중, 역학 조사에서 크게 주목 받고 있는 심혈관 질환의 원인을 규명하고자 하였다. 본 연구는 심혈관계 질환의 발병 및 진전에 큰 역할을 하는 혈소판을 대상으로 하고 있으며, 혈소판과 혈액 응고계, 혈소판과 내피 세포와의 상호 작용에 비소가 어떠한 영향을 미치는지 파악하고자 하였다. 이러한 비소의 효과는 만성적인 비소 노출에서 보고되는 심혈관 질환 발병의 중요한 원인이 될 수 있을 것이라 사료된다. 나아가, 이러한 원인 규명은 비소 오염에서 보고되는 만성적인 질환의 치료 및 예방에 기여할 것으로 판단된다.
  • Index terms
  • 비소 (arsenic), 혈소판 (platelet), 혈액 응고 촉진 활성 (procoagulant activity), 부착 단백 발현 (adhesion molecule expression), 심혈관 질환 (cardiovascular disease)
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