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https://www.krm.or.kr/krmts/link.html?dbGubun=SD&m201_id=10007112&local_id=10019842
흰쥐 뇌에서 NELL2와 TTF-1에 의한 생식주기 조절에 관한 연구
Reports NRF is supported by Research Projects( 흰쥐 뇌에서 NELL2와 TTF-1에 의한 생식주기 조절에 관한 연구 | 2004 Year 신청요강 다운로드 PDF다운로드 | 류병준(울산대학교) ) data is submitted to the NRF Project Results
Researcher who has been awarded a research grant by Humanities and Social Studies Support Program of NRF has to submit an end product within 6 months(* depend on the form of business)
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  • Researchers have entered the information directly to the NRF of Korea research support system
Project Number C00027
Year(selected) 2004 Year
the present condition of Project 종료
State of proposition 재단승인
Completion Date 2008년 10월 30일
Year type 결과보고
Year(final report) 2008년
Research Summary
  • Korean
  • 흰쥐 뇌에서 NELL2와 TTF-1에 의해 생리주기 (estrous cycle) 가 조절됨을 확인하였다.
    먼저, Chick embryo 에서 처음 발견된 Nel (Neural tissue specific EGF-Like repeat domain containing protein)은 인간 뇌에서 NELL1과 NELL2라는 유사한 유전자가 library 실험을 통해 보고되었다. 그리고, NELL2는 chicken Nel 처럼 신경계에서 강하게 발현되었다. 본 연구에서는 NELL2 가 흰쥐의 estrous cycle을 조절한다는 가설을 확인한 것으로 NELL2 antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN) 을 이용하여 뇌에서 NELL2 합성을 억제하고, real-time PCR 을 이용하여 reproductive regulation factor, KiSS-1의 변화 양상을 확인하였다. 결과적으로 NELL2 합성을 억제하였을 때 glutamate release가 억제되었고, estrous cycle 이 멈추었다. 이것은 NELL2가 정상적인 reproductive cycle 유지에 필요한 새로운 요소임을 보여주는 결과이다. 그리고, Nkx family의 하나인 homeodomain containing transcription factor (thyroid transcription factor, TTF-1) 은 간뇌 형태 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 선행된 연구에서 TTF-1은 출생 후에도 시상하부지역에서 발현되고, LHRH와 PACAP의 gene transcription 을 조절할 가능성이 있음을 확인하였다. 특히, LHRH 는 성체 흰쥐의 ovulation에 중요한 hormone으로 알려져 있고, proestrus 오후에 surge가 있으며, 이것은 circadian rhythm의 영향을 받는 것으로 생각되고 있다. 본 연구에서는 24시간 동안 흰쥐 hypothalamus 에서 LHRH 와 TTF-1의 mRNA 변화를 RNase Protection Assay를 통해 확인하였고, LHRH release hypothalamic neuronal cell-line, GT1-7에서 luciferase promoter assay와 EMSA, 그리고, real-time PCR을 이용해 gene expression 조절을 확인하였다. 결과적으로 TTF-1은 그것 자신이 circadian rhythm을 가지며, LHRH promoter 부위에 직접적으로 결합하여 circadian rhythm을 조절할 수도 있지만, 다른 circadian oscillators, Per1, Per2와 결합하여 LHRH 의 transcription 을 조절한다. 결과적으로 NELL2와 TTF-1은 동물수준과 세포수준에서 estrous cycle 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다.
  • English
  • Nel (Neural tissue specific EGF-Like repeat domain containing protein) has been isolated from neural tissues of chick embryos. Subsequently two Nel-like genes, NELL1 and NELL2, were isolated from a human fetal brain library. NELL2 appears the mammalian counterpart of chicken Nel. As in chickens, NELL2 is strongly expressed in the nervous system, in particular is only present in particular is only present in neurons.
    Previously we found that NELL2 is expressed in some subsets of glutamatergic neurons in the hypothalamus. Glutamate plays an important role for inducing a rapid increase in luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) and luteinizing hormone (LH) release in the female rats. Glutamatergic input to the LHRH neuronal system is likely to be mediated by direct synapses at the LHRH cell bodies or dendrites, or by asynaptic neurotransmission at the median eminence. In this study we investigated the physiological effect of NELL2 on the rat estrous cycle by quantitative real-time PCR. An antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN) against translation initiation site of NELL2 mRNA was i.c.v.-injected into the third ventricle of the adult female rat brain. This injection induced a disruption of NELL2 synthesis and in turn, resulted in a decrease of glutamate release from the in vitro cultured hypothalamus. Moreover, the estrous cycle of animals was stopped, by the AS-ODN injection, at the diestrous stage. Our results suggest that NELL2 acts as a new component of machinery regulating glutamate release and thereby, facilitates a process for maintaining normal reproductive cycle.
    And, a Homeodomain containing transcription factor (thyroid transcription factor, TTF-1) is a member of the Nkx family of homeodomain-containing transcription factors required for morphogenesis of the fetal diencephalic development. Previously we found that TTF-1 is postnatally expressed in the hypothalamus and regulates several target genes such as luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH, gonadotrophin-releaseing hormone; GnRH) and pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. In the present study, we have examined a possible role of TTF-1 in the regulation of circadian rhythm of LHRH gene expression. TTF-1 and LHRH mRNAs extracted from the rat hypothalami were determined using RNase protection assay (RPA). They both showed a clear circadian rhythm and were at low levels during the day, while high during the night. To explore molecular mechanism of LHRH transcription by TTF-1 in the GT1-7 cell lines, we performed promoter activity assay of LHRH under the control of TTF-1 using luciferase and secretary alkaline phosphatase (SEAP) as reporters. We found that two TTF-1 binding motifs in the LHRH promoter are essential to the TTF-1 dependent activation of LHRH transcription. SEAP assay showed that LHRH transcription in the GT1-7 cells has a unique circadian rhythm and amplitude of the rhythm was repressed by Clock/Bmal1 dimers and TTF-1 inhibited Clock/Bmal1-induced transactivation of the mouse Per1 promoter. These data suggest that TTF-1 plays a critical in the regulation of circadian rhythm of LHRH gene expression via interacting with molecular oscillators.
    In summary, I report here that a NELL2 could be an important modulator for estrogen action in the regulation of reproductive cyclicity, possibly through modulation of KiSS1 and LHRH neuronal activity in the adult female rat hypothalamus. And, although the actual functions of TTF-1 remain unclear, however, TTF-1 have a circadian rhythm by serum shock in the GT1-7, regulate LHRH gene expression as circadian oscillator.
Research result report
  • Abstract
  • Chaptor 1. Chick embryo 에서 처음 발견된 Nel (Neural tissue specific EGF-Like repeat domain containing protein)은 인간 뇌에서 NELL1과 NELL2라는 유사한 유전자가 library 실험을 통해 보고되었다. 그리고, NELL2는 chicken Nel 처럼 신경계에서 강하게 발현되었다.
    선행 연구에서 본 연구자는 NELL2가 시상하부의 glutamatergic neuron에서 발현됨을 확인하였고 그로 인하여 luteininzing hormone-releasing hormone (LHRH)과 luteinizing hormone (LH) 분비를 조절함을 확인하였다.
    본 연구에서는 NELL2 가 흰쥐의 estrous cycle을 조절한다는 가설을 확인한 것으로 NELL2 antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN) 을 이용하여 뇌에서 NELL2 합성을 억제하고, real-time PCR 을 이용하여 reproductive regulation factor, KiSS-1의 변화 양상을 확인하였다. 결과적으로 NELL2 합성을 억제하였을 때 glutamate release가 억제되었고, estrous cycle 이 멈추었다. 이것은 NELL2가 정상적인 reproductive cycle 유지에 필요한 새로운 요소임을 보여주는 결과이다.
    Chaptor 2
    Nkx family의 하나인 homeodomain containing transcription factor (thyroid transcription factor, TTF-1) 은 간뇌 형태 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 선행된 연구에서 TTF-1은 출생 후에도 시상하부지역에서 발현되고, LHRH와 PACAP의 gene transcription 을 조절할 가능성이 있음을 확인하였다. 특히, LHRH 는 성체 흰쥐의 ovulation에 중요한 hormone으로 알려져 있고, proestrus 오후에 surge가 있으며, 이것은 circadian rhythm의 영향을 받는 것으로 생각되고 있다.
    본 연구에서는 24시간 동안 흰쥐 hypothalamus 에서 LHRH 와 TTF-1의 mRNA 변화를 RNase Protection Assay를 통해 확인하였고, LHRH release hypothalamic neuronal cell-line, GT1-7에서 luciferase promoter assay와 EMSA, 그리고, real-time PCR을 이용해 gene expression 조절을 확인하였다. 결과적으로 TTF-1은 그것 자신이 circadian rhythm을 가지며, LHRH promoter 부위에 직접적으로 결합하여 circadian rhythm을 조절할 수도 있지만, 다른 circadian oscillators, Per1, Per2와 결합하여 LHRH 의 transcription 을 조절한다.
  • Research result and Utilization method
  • 연구결과 - Chapter 1에서는 NELL2 Anti-sense Oligodeoxynucleotide을 i.c.v injection을 혀여 NELL2억제시 estrous cycle이 멈춤을 Vaginal smear를 이용해서 확인한 후 Real-time PCR 과 Western blot을 이용해서 mRNA 와 protein level 에서 영향을 받았는지 확인하였고, estrogen의 의한 LHRH neuron 의 활성화 factor로 알려진 KiSS-1유전자와의 관계도 확인하였다. 결국, NELL2에 의한 영향이 KiSS-1을 통해서 HPG axis에 작용할 수 있음을 확인하였다. 그리고, Chaptor 2에서는 먼저, 생리주기 조절에 있어 중요한 생식소자극호르몬-자극 호르몬인 LHRH와 TTF-1의 Expression pattern을 RNase Protection Assay를 통해서 확인하고, LHRH release cell-line 인 GT1-7 cell 을 이용하여 세포수준에서도 Circadian rhythm을 가지는 지를 Serum shock 과 Real-time PCR을 이용해서 확인한다. 그리고, TTF-1 이 LHRH의 up-stream 조절자로서 작용하는지는 Reporter Vector를 이용한 Luciferase Promoter Assay 를 통해 알아보고 마지막으로 어떻게 작용하는지, Circadian Oscillators 와 함께 작용하는지를 Immunoprecipitation 실험을 통해 확인한다.
    활용방안 - 국내의 경우 최근에 생체의 일주기시계 연구를 수행하는 몇몇의 연구진이 활동하고 있으나 국내 연구는 아직 초보단계로서 국제적인 수준을 100%로 계산할 때, 국내 수준은 30%에도 미치지 못할 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고, 국제적인 연구 선도그룹의 관심이 SCN, 송과선 등에서 최초의 생체시계가 어떻게 작동되는지 이를 조절하는 조절인자들로서 어떤 것들이 더 있는지 그리고, 생리주기 조절에는 어떠한 과정을 거치는지 에 대해 집중하고 있음으로, 본 연구는 LHRH release 상에서 생체시계의 조절과 생리주기 조절에서 생체시계가 어떻게 작용하는지에 대한 이해의 폭을 넓히고, 향후 불임과 관련된 질병과 관련한 국제적인 경쟁력을 충분히 가질 수 있을 것으로 생각한다. 또한 뇌의 사춘기 개시 조절 기작이 분자생물학적으로 정확히 규명되어 사람의 관련 질병의 치료는 물론, 가축의 조기 성장유도, 조숙 유도 등에 활용할 날이 올 것을 전망되며, 생체의 일주기 조절기작, 세포의 자체 리듬조절기작 등이 규명되고, 이를 활용하는 무수히 많은 연구 분야의 개척이 이루어질 것으로 생각된다.
  • Index terms
  • NELL2, LHRH, hypothalamus, reproductive cycle, antisense oligodeoxynucleotide,thyroid transcription factor, luteinizing hormone-releasing hormone, preoptic area, circadian rhythm, Clock, Bmal1, Per1, RNase protection assay, secretary alkaline phosphatase assay
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