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https://www.krm.or.kr/krmts/link.html?dbGubun=SD&m201_id=10007134&local_id=10011451
Plasminogen activator inhibitor-1의 잠복형 전환 조절기작 연구
Reports NRF is supported by Research Projects( Plasminogen activator inhibitor-1의 잠복형 전환 조절기작 연구 | 2004 Year 신청요강 다운로드 PDF다운로드 | 나유란(세종대학교) ) data is submitted to the NRF Project Results
Researcher who has been awarded a research grant by Humanities and Social Studies Support Program of NRF has to submit an end product within 6 months(* depend on the form of business)
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  • Researchers have entered the information directly to the NRF of Korea research support system
Project Number C00016
Year(selected) 2004 Year
the present condition of Project 종료
State of proposition 재단승인
Completion Date 2006년 05월 25일
Year type 결과보고
Year(final report) 2006년
Research Summary
  • Korean
  • Plasminogen activator inhibitor-1은 tissue-type plasminogen activator와 urokinase-type plasminogen activator의 주요 저해제로서, 생체 내 혈전 융해를 조절하는 주요인자이다. Plasminogen activator inhibitor-1은 같은 serine protease inhibitors 계열 단백질들과는 달리 생리적인 환경 하에서 쉽게 구조전환이 일어나 활성이 없는 잠복형 (latent form)으로 전환되는 특징을 가지고 있다. 본 연구를 통해 Plasminogen activator inhibitor-1의 latent로의 전환 속도와 reactive center loop (RCL) 길이 사이의 관계를 먼저 규명하였다. RCL 길이의 증가는 PAI-1의 urea-stable form으로의 구조적 전환을 촉진하는 것을 알 수 있었다. 또한 이들 mutants들의 안정성의 증가와 proteolytic resistance는, 이 형태가 RCL이 A β-sheet으로 삽입되어 형성되는 latent form과 유사한 구조를 갖고 있음을 시사한다. 반면 RCL 길이의 단축은 PAI-1을 kinetic trap에 머물게 하여, deletion mutants의 경우 37℃에서 4 시간 까지 incubation하는 동안에도 latent form이 형성되지 않았다. Insertion mutants에서 보여지는 latent transition의 촉진은 native state의 불안정화 또는, kinetic barrier가 낮아진 결과일 수 있다. 이것을 알아보기 위해 본 연구에서는 mutation에 의한 native stability와 conversion rate을 분석하였다. Insertion mutants의 native form의 구조적 안정성은 wild-type PAI-1과 유사하였으나, 구조전환 속도는 매우 촉진 또는 저해되었으므로, conversion rates의 변화는 native 형태의 불안정화에 의한 것이라기 보다는 kinetic barrier의 변형에 의해 이루어진 것임을 확인할 수 있었다. 이 결과는 PAI-1의 RCL polypeptide connection이 낮은 에너지 상태로의 구조전환을 막아주는 중요한 요소이며, RCL의 연장이 이러한 kinetic trap으로부터 벗어나게 해준 것임을 보여준다.
    또한 native와 latent form의 구조를 비교 분석한 결과 s1C(C β-sheet의 첫번째 strand)와 이웃한 부위와의 상호작용은 두 구조에서 현격한 차이를 보이는 부위이며, s1C가 벗겨지는 과정이 latent conversion을 조절할 것으로 생각되어, PAI-1의 이 부위 상호작용의 중요성을 심층 분석하기 위하여 s1C의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환해 준 후 이로 인한 PAI-1의 구조전환에의 영향을 연구하였다.
    Glu350, Ile352, Ile353을 크기가 더 작은 다른 아미노산으로 치환한 경우 잠복형으로의 구조전환 속도가 빨라졌으며, Glu351의 경우에는 특이하게도 더 작은 Ala로 치환된 경우 기능적 안정성이 증가되었다. Met354위치는 분자내부를 향하고 있으며, 이 부위의 상호작용을 강화해주는 다른 아미노산으로의 치환은 구조전환을 억제하는 효과를 보여주었다. Asp355와 Arg356위치에 유도된 모든 변이주에서는 구조전환이 매우 빠른 속도로 일어났다. 본 연구를 통해 s1C에 존재하는 아미노산들이 slC의 방출에 관여하고 있다는 것을 알 수 있었다. 그러나 이러한 기능적 안정성의 증가와 감소는 mutants의 native형태의 불안정화에 의한 것이 아닌 것으로 관찰되었다. 전체적인 구조적 안정화와 기능적 안정성의 증가에는 약간의 상관관계가 있지만, 전반적으로 기능적 안정성 증감에 비해 모든 변이주의 구조적 안정성은 상당히 유사함을 알 수 있었다. 이러한 이유로 s1C에 대한 돌연변이로 인한 기능적 안정성의 변화는 native형태의 불안정화에 의한 것이라기 보다는 metastable한 형태에서 stable형태로의 전환을 억제해 주고 있던 energy barrier의 변화에 의한 것임을 알 수 있었다. 즉 s1C에 존재하는 상호작용이 특이적으로 PAI-1의 구조전환을 조절하는 요인으로 작용하였다.
  • English
  • Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) belongs to the serine protease inhibitor (serpin) protein family, which has a common tertiary structure consisting of three ß-sheets and several α-helices. Despite the similarity of its structure with those of other serpins, PAI-1 is unique in its conformational lability, which allows the conversion of the metastable active form to a more stable latent conformation under physiological conditions. For the conformational conversion to occur, the reactive center loop (RCL) of PAI-1 must be mobilized and inserted into the major ß-sheet, A sheet. In an effort to understand how the structural conversion is regulated in this conformationally labile serpin, we modulated the length of the RCL of PAI-1. We show that releasing the constraint on the RCL by extension of the loop facilitates a conformational transition of PAI-1 to a stable state. Biochemical data strongly suggest that the stabilization of the transformed conformation is owing to the insertion of the RCL into A ß-sheet, as in the known latent form. In contrast, reducing the loop length drastically retards the conformational change. The results clearly show that the constraint on the RCL is a factor that regulates the conformational transition of PAI-1.
    The transition from the active to the latent form involves insertion of the reactive center loop into β-sheet A as the 4th strand. Insertion of the proximal hinge region of the RCL would peel off s1C from β-sheet C, and the C-terminal region of the RCL should pass through the gate region.
    To study the detailed contribution of each residues on s1C, the amino acid substitution introduced on the s1C of PAI-1.
    Reducing the residue size at position P4’, P6’, and P7' accelerated the conformational transition of PAI-1 to the latent form. The opposite effects of substitutions were observed at position P5’: substitution of Glu 351 for Ala, Gln, and Lys showed stabilizing, little and destabilizing effects on latency transition, respectively. All substitutions made at position P9’, P10’ facilitated latency transition.
    These results indicate that intramolecular interactions at s1C regulate the latency transition of PAI-1.
Research result report
  • Abstract
  • Plasminogen activator inhibitor-1은 tissue-type plasminogen activator와 urokinase-type plasminogen activator의 주요 저해제로서, 생체 내 혈전 융해를 조절하는 주요인자이다. Plasminogen activator inhibitor-1은 같은 serine protease inhibitors 계열 단백질들과는 달리 생리적인 환경 하에서 쉽게 구조전환이 일어나 활성이 없는 잠복형 (latent form)으로 전환되는 특징을 가지고 있다. 본 연구를 통해 Plasminogen activator inhibitor-1의 latent로의 전환 속도와 reactive center loop (RCL) 길이 사이의 관계를 먼저 규명하였다. RCL 길이의 증가는 PAI-1의 urea-stable form으로의 구조적 전환을 촉진하는 것을 알 수 있었다. 또한 이들 mutants들의 안정성의 증가와 proteolytic resistance는, 이 형태가 RCL이 A β-sheet으로 삽입되어 형성되는 latent form과 유사한 구조를 갖고 있음을 시사한다. 반면 RCL 길이의 단축은 PAI-1을 kinetic trap에 머물게 하여, deletion mutants의 경우 37℃에서 4 시간 까지 incubation하는 동안에도 latent form이 형성되지 않았다. Insertion mutants에서 보여지는 latent transition의 촉진은 native state의 불안정화 또는, kinetic barrier가 낮아진 결과일 수 있다. 이것을 알아보기 위해 본 연구에서는 mutation에 의한 native stability와 conversion rate을 분석하였다. Insertion mutants의 native form의 구조적 안정성은 wild-type PAI-1과 유사하였으나, 구조전환 속도는 매우 촉진 또는 저해되었으므로, conversion rates의 변화는 native 형태의 불안정화에 의한 것이라기 보다는 kinetic barrier의 변형에 의해 이루어진 것임을 확인할 수 있었다. 이 결과는 PAI-1의 RCL polypeptide connection이 낮은 에너지 상태로의 구조전환을 막아주는 중요한 요소이며, RCL의 연장이 이러한 kinetic trap으로부터 벗어나게 해준 것임을 보여준다.
    또한 native와 latent form의 구조를 비교 분석한 결과 s1C(C β-sheet의 첫번째 strand)와 이웃한 부위와의 상호작용은 두 구조에서 현격한 차이를 보이는 부위이며, s1C가 벗겨지는 과정이 latent conversion을 조절할 것으로 생각되어, PAI-1의 이 부위 상호작용의 중요성을 심층 분석하기 위하여 s1C의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환해 준 후 이로 인한 PAI-1의 구조전환에의 영향을 연구하였다.
    Glu350, Ile352, Ile353을 크기가 더 작은 다른 아미노산으로 치환한 경우 잠복형으로의 구조전환 속도가 빨라졌으며, Glu351의 경우에는 특이하게도 더 작은 Ala로 치환된 경우 기능적 안정성이 증가되었다. Met354위치는 분자내부를 향하고 있으며, 이 부위의 상호작용을 강화해주는 다른 아미노산으로의 치환은 구조전환을 억제하는 효과를 보여주었다. Asp355와 Arg356위치에 유도된 모든 변이주에서는 구조전환이 매우 빠른 속도로 일어났다. 본 연구를 통해 s1C에 존재하는 아미노산들이 slC의 방출에 관여하고 있다는 것을 알 수 있었다. 그러나 이러한 기능적 안정성의 증가와 감소는 mutants의 native형태의 불안정화에 의한 것이 아닌 것으로 관찰되었다. 전체적인 구조적 안정화와 기능적 안정성의 증가에는 약간의 상관관계가 있지만, 전반적으로 기능적 안정성 증감에 비해 모든 변이주의 구조적 안정성은 상당히 유사함을 알 수 있었다. 이러한 이유로 s1C에 대한 돌연변이로 인한 기능적 안정성의 변화는 native형태의 불안정화에 의한 것이라기 보다는 metastable한 형태에서 stable형태로의 전환을 억제해 주고 있던 energy barrier의 변화에 의한 것임을 알 수 있었다. 즉 s1C에 존재하는 상호작용이 특이적으로 PAI-1의 구조전환을 조절하는 요인으로 작용하였다.
  • Research result and Utilization method
  • 본 연구를 통하여 박사학위를 취득하였으며, 이를 토대로 해외 (Purdue Univeristy)로 박사후 과정을 수행하기 위하여 출국할 예정이다. 연구결과는 국제학술지에 발표할 계획이며, 학문적으로 단백질 폴딩과 구조전환에 관한 새로운 지식을 제공하여 주었다.
    또한 본 연구는 단백질의 구조전환 기작을 규명하여 분자스위치를 고안하는데 응용될 수 있으며, 실용적으로는 단백질 의약품의 상용화를 위하여 필수적인 기능적 안정성 확보에 이용될 수 있다.
  • Index terms
  • Plasminogen activator inhibitor-1, serine protease inhibitor, conformational transition, 구조적 안정성, 단백질 폴딩
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