15-Deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2 (15d-PGJ2), an endogenous ligand for peroxisome proliferator-activated receptor-γ, has been shown to induce apoptosis in various types of cells. However, this cyclopentenone prostaglandin, characterized by the presenc ...

15-Deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2 (15d-PGJ2), an endogenous ligand for peroxisome proliferator-activated receptor-γ, has been shown to induce apoptosis in various types of cells. However, this cyclopentenone prostaglandin, characterized by the presence of a highly reactive α,β-unsaturated carbonyl group, also exerts cytoprotective effects. In the present work, we found that treatment of human breast cancer (MCF-7) cells with 15d-PGJ2 led to concentration- and time-dependent increases in the expression and activity of heme oxygenase-1 (HO-1), a ubiquitous stress-responsive enzyme. Elevated expression or activity of HO-1 has been reported to stimulate proliferation and to accelerate angiogenesis in several tumor cells. 15d-PGJ2 at 30 μM induced phosphorylation of Akt and ERK1/2 in 6 h and 12 h, respectively. Up-regulation of HO-1 by 15d-PGJ2 was abolished by pretreatment with the phosphatidyl inositol-3 kinase (PI3K) inhibitor LY294002, but not with the MEK inhibitor U0126. To confirm whether the HO-1 expression is mediated by Akt that is downstream of PI3K, we transfected MCF-7 cells with full length Akt or Kinase-Dead Akt (KD-Akt) vector. KD-Akt transfection abolished HO-1 expression as well as HO-1 activity. These results suggest that induction of HO-1 expression can be regulated via the PI3K-Akt pathway. Nrf2, a basic-leucine zipper transcription factor, has been reported to positively regulate the antioxidant response element (ARE)-mediated expression of various phase-2 detoxifying or antioxidant enzymes including HO-1. 15d-PGJ2 induced increased nuclear translocation as well as expression of Nrf2, leading to elevated Nrf2-ARE binding. The promoter activity assessed by using the luciferase reporter construct harbouring ARE consensus sequences was increased by 15d-PGJ2 in transiently transfected MCF-7 cells. Mutation of the GC box in the ARE core sequence obliterated the 15d-PGJ2-induced transcriptional activity of Nrf2. Treatment of MCF-7 cells with LY294002 or transient transfection with KD-Akt abrogated 15d-PGJ2-induced Nrf2 activation and ARE binding activity. MCF-7 cells transfected with dominant negative Nrf2 were less responsive to 15d-PGJ2-induced expression and activity of HO-1. 9,10-Dihydro-15d-PGJ2, a 15d-PGJ2 analog lacking the reactive α,β-unsaturated carbonyl group, failed to induce HO-1 expression as well as Nrf2 activation and Akt phosphorylation.

본 연구에서는 15d-PGJ2가 세포 독성을 나타내지 않는 농도에서 항산화 효소인 HO-1의 발현을 유도하는 자세한 분자적 작용 메카니즘을 규명하고자 하였다. 그 과정에서 15d-PGJ2에 의한 HO-1 발현 유도에 관여하는 상위 인산화 효소들의 활성화를 Western blot analysis ...

본 연구에서는 15d-PGJ2가 세포 독성을 나타내지 않는 농도에서 항산화 효소인 HO-1의 발현을 유도하는 자세한 분자적 작용 메카니즘을 규명하고자 하였다. 그 과정에서 15d-PGJ2에 의한 HO-1 발현 유도에 관여하는 상위 인산화 효소들의 활성화를 Western blot analysis를 이용하여 검색하고, 이 때 각 인산화 효소의 pharmacologic inhibitor들과 dominant negative vector를 사용하여 그 조절 여부를 확인하였다. 또한 항산화효소의 발현을 조절한다고 알려진 전사인자인 Nrf2의 dominant negative vector를 이용하여 Western blot analysis와 PCR, 그리고 EMSA 등의 방법을 통하여 실제적으로 Nrf2가 15d-PGJ2에 의한 HO-1의 발현 유도를 조절하는 지를 규명함으로써 HO-1 발현이 조절되는 근본적인 기전을 밝히고, 암세포의 자가 세포 보호 효과를 확인하였다.
인체 유방암 (MCF-7) 세포에 15d-PGJ2를 처리한 결과 HO-1의 단백질 및 mRNA 발현과 HO의 활성이 현저히 증가되었으며, microarray data에서도 15d-PGJ2에 의해 HO-1 유전자가 control에 비해 90 배가 증가하는 것을 관찰하였다. 15d-PGJ2로 인한 HO-1의 발현 조절기전을 규명하기 위하여 HO-1 유전자 promoter 부위에 결합 가능한 전사인자인 Nrf2의 활성을 검토한 결과, 15d-PGJ2를 처리함으로써 Nrf2의 핵 내 이동과 ARE binding activity가 증가되었으며, 반대로 Nrf2의 dominant-negative mutant와 Nrf2 si-RNA를 transfection하여 Nrf2의 활성을 억제한 경우, 15d-PGJ2으로 유도된 HO-1의 발현을 억제하였다. 또한 MCF-7 세포에 15d-PGJ2를 처리한 결과 Akt의 활성이 증가되었으며 Akt 저해제인 LY294002를 전처리하거나 그 기능이 소실된 kinase-dead mutant Akt를 transfection하여 Akt의 활성을 억제한 경우, Nrf2-ARE binding 및 transcriptional activity 및 HO-1의 발현이 감소되었다. 이상의 결과는 15d-PGJ2에 의한 HO-1의 유도가 PI3K/Akt 및 Nrf2의 활성화를 통해 일어남을 시사한다.
본 연구는 암세포의 자가세포사멸을 유도함으로써 암 치료에 대한 새로운 가능성으로 주목받고 있는 15d-PGJ2의 bifunctional effect에 대한 것이다. 따라서, 이 연구는 항암제를 이용한 암 치료시 발생하는 여러 약제 내성 및 adaptive response의 기작을 세포 및 분자 수준에서 규명하는데 중요한 단서를 제공할 수 있을 것이며, 또한, 염증의 대표적 marker인 COX-2와 관련하여 세포증식 및 사멸에 대한 조절 기전을 밝힐 수 있을 것이며, 이러한 작용 기작의 규명을 통해 의료 생명공학 관련산업의 국제 경쟁력을 높일 수 있으리라 사료된다.