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유전자 칩을 이용한 fractalkine의 혈관신생 기전연구
Reports NRF is supported by Research Projects( 유전자 칩을 이용한 fractalkine의 혈관신생 기전연구 | 2005 Year 신청요강 다운로드 PDF다운로드 | 이선진(강원대학교) ) data is submitted to the NRF Project Results
Researcher who has been awarded a research grant by Humanities and Social Studies Support Program of NRF has to submit an end product within 6 months(* depend on the form of business)
  • Researchers have entered the information directly to the NRF of Korea research support system
Project Number E00005
Year(selected) 2005 Year
the present condition of Project 종료
State of proposition 재단승인
Completion Date 2007년 01월 10일
Year type 결과보고
Year(final report) 2007년
Research result report
  • Abstract
  • Endothelial cells are important role of the new vessel formation, respectively physiological conditions as well as pathophysiological conditions, such as wound healing, atherosclerosis, rheumatoid arthritis, menstruation, hypertension, and ischemia/reperfusion damage. In these conditions, endothelial cells modulate angiogenesis and cell death and regulated by various growth factors, cytokines, and metabolite. However, these molecular mechanisms are not elucidated. I investigated angiogenesis by fractalkine and apoptosis by homocysteine and their underlying signaling mechanism.

    Part I. Fractalkine stimulates angiogenesis by activating the Raf1/MEK/ERK- and PI3K/Akt/ eNOS-dependent signal pathways
    I here investigated the molecular mechanism by which FKN regulates angiogenesis. I here found that recombinant FKN increased in vitro proliferation, migration, and tube formation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), as well as stimulated in vivo angiogenesis. FKN-induced angiogenesis was accompanied by phosphorylation of ERK, Akt, and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) as well as an increase in NO production. These biochemical events and angiogenesis were completely inhibited by the G protein-coupled receptor inhibitor pertussis toxin. Inhibitors of Raf-1, MEK, PI3K, and eNOS or transfection with dominant negative ERK and Akt significantly suppressed the angiogenic activity of FKN. However, inhibitors of Raf-1 and MEK blocked FKN-induced ERK phosphorylation, but not Akt and eNOS phosphorylation. The PI3K inhibitor suppressed Akt and eNOS phosphorylation and NO production. My results demonstrated that FKN stimulated angiogenesis by activating both the Raf-1/MEK/ERK and PI3K/Akt/eNOS/NO signal pathways via the G protein-coupled receptor CX3CR1, indicating that two pathways are required for full angiogenic activity of FKN. This study suggests that FKN may play an important role in pathophysiological process of inflammatory angiogenesis.


    Part II. Nitric oxide inhibition of homocysteine-induced human endothelial cell apoptosis by down-regulation of p53-dependent Noxa expression through the formation of S-nitrosohomocysteine
    I examined the molecular mechanism by which homocysteine (HCy) causes endothelial cell apoptosis and by which nitric oxide (NO) affects HCy-induced apoptosis. My data demonstrated that HCy caused caspase-dependent apoptosis in cultured HUVECs, as determined by cell viability, nuclear condensation, and caspase-3 activation and activity. These apoptotic characteristics were correlated with reactive oxygen species (ROS) production, lipid peroxidation, p53 and Noxa expression, and mitochondrial cytochrome c release following HCy treatment. HCy also induced p53 and Noxa expression and apoptosis in endothelial cells from wild type mice, but not in the p53-deficient cells. The NO donor S-nitroso-N-acetlylpenicillamine, adenoviral iNOS vector (AdiNOS) transfection, and antioxidants (α-tocopherol and superoxide dismutase plus catalase), but not oxidized SNAP, 8-Br-cGMP, nitrite, and nitrate, suppressed ROS production, p53-dependent Noxa expression, and apoptosis induced by HCy. The cytotoxic effect of HCy was decreased by siRNA-mediated suppression of Noxa expression, indicating that Noxa upregulation plays an important role in HCy-induced endothelial cell apoptosis. AdiNOS transfection increased the formation of S-nitrosoHCy (S-NOHCy), which was inhibited by the NOS inhibitor N-monomethyl-L-arginine. Moreover, S-NOHCy did not increase ROS generation, p53-dependent Noxa expression, and apoptosis. These results suggest that up-regulation of p53-dependent Noxa expression may play an important role in the pathogenesis of atherosclerosis induced by HCy and that an increase in vascular NO production may prevent HCy-induced endothelial dysfunction by S-nitrosylation.
  • Research result and Utilization method
  • 내피세포는 새로운 혈관형성에 중요한 역할을 하며 특히 상처치유, 동맥경화, 류마티스 관절염, 생리, 고혈압 그리고 허혈성 질환등과 같이 생리적 및 병리적인 환경에서 중요하다. 이러한 환경에서 내피세포는 혈관신생기전과 세포사멸등을 조율하고 다양한 성장인자, 사이토카인, 및 대사산물에의해 조절된다. 그러나 이러한 물질의 기전들은 아직까지 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 첫 번째로fractalkine (FKN)에 의한 혈관신생기전에 대한 연구를 수행하였고 두 번째로는 homocysteine (HCy)에 의한 세포사멸 및 신호전달기전에 대한 연구를 수행하였다.
    첫 번째로, fractakine이 Raf-1/MEK/ERK 및 PI3K/Akt/eNOS에 의존적인 경로를 활성화함으로써 혈관신생을 유도한다는 내용에 대해 실험하였다. 본 연구에서는 재조합된 FKN이 in vitro에서 내피세포의 증식, 이동 및 관형성을 증가시키는 것을 알아내었고, 또한 in vivo에서도 확인하였다. FKN 유도의 혈관신생은 ERK, Akt, 그리고 NO의 생성을 증가시키는 eNOS의 인산화에 의해 수행되었다. 이러한 생화학적인 사건들과 혈관신생은 G protein-coupled 수용체의 저해제인 pertussis toxin에 의해 확실하게 저해되었다. 뿐만 아니라, Raf-1, MEK, PI3K, 그리고 eNOS의 저해제 혹은 dominant negative ERK, 맛의 형질유도는 FKN의 혈관신생 능력을 감소시켰다. 하지만, Raf-1과 MEK의 저해제는 FKN 유도의 ERK 인산화를 저해하나, Akt 및 eNOS의 인산화를 저해시키지는 못하였다. 본 연구의 내용에서는 FKN이 G protein-coupled 수용체인 CX3CR1을 통해 Raf-1/MEK/ERK 및 Pi3K/Akt/eNOS/NO의 신호전달을 모두 활성화시킴으로써 혈관신생 유도를 자극한다는 것을 확인하였다.
    이러한 연구는 FKN이 향후 염증반응성 혈관신생의 병리적 수행과정에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 제안하고자 한다. 또한 DNA chip을 수행하면서 새로운 유전자의 동정을 통해 새로운 project를 유도할 수 있는 계기를 얻을 수가 있었다.
    두번째로, S-nitrosohomocysteine의 형성이 p53 의존적인 Noxa 발현의 감소로 HCy유도의 내피세포사멸에 대한 일산화질소의 세포사멸 억제 연구를 수행하였다. 본 연구에서는 HCy이 내피세포의 세포사멸의 기전과 일산화질소가 HCy 유도의 세포사멸에 미치는 영향에 대한 기전을 연구하였다. 본 실험 결과는 cell viability, nuclear condensation, 그리고 caspase-3 활성화에 대한 실험을 통해 HCy이 내피세포에서 caspase의존적인 세포사가 일어남을 확인하였다. 이러한 HCy세포사의 특성은 활성 산소종의 생성과 지질과산화, p53 그리고 Noxa의 발현, cytochrome c의 방출과 관련이 있었다. 또한 HCy은 정상쥐로부터 분리한 내피세포에서 p53 및 Noxa발현을 통해 세포사멸을 유도하였으나 p53이 결핍된 쥐의 내피세포에서는 세포사멸이 유도되지 않았다. 일산화질소 공여자인 SNAP, AdiNOS의 형질유도, 그리고 항산화제 (-tocopherol, superoxide dismutase와 catalase)는 활성산소종과 p53의존적인 Noxa 발현을 통한 HCy유도의 세포사를 저해하였으나, 산화된 SNAP, 8-Br-cGMP, 이산화질소, 그리고 삼산화질소는 저해시키지 못하였다. HCy의 효과는 세포사멸에 중요한 역할을 하는 Noxa를 siRNA로 knockdown시킴으로서 저해되었고, AdiNOS 형질유도는 S-NOHCy 형성을 증가시켰고, NMA는 억제하였다. 더욱이 S-NOHCy는 활성산소종의 생성, p53의존적인 Noxa발현 및 세포사멸을 증가시키지 못하였다. 이러한 결과는 p53의존적인 Noxa의 발현 증가는 HCy유도의 동맥경화의 병리적 환경에서 중요한 역할을 하며 혈관의 일산화질소의 증가는 S-nitrosylation에 의한 HCy유도의 내피세포 기능 상실을 억제 할 수 있는 가능성을 제시한다.
  • Index terms
  • bFGF basic fibroflast growth factor cGMP cyclic guanosine monophosphate DAF-FM 4-amino-5methylamino-2’7’-difluorofluorescein DCF-DA Dichlorofluorescin diacetate EGF-1 epidermal growth factor-1 FKN fractalkine GPCR G protein-coupled receptor HCy Homocysteine HUVEC human umbilical vein endothelial cel MDA malondialdehyde MLEC Murine lung endothelial cell MMP matrix matalloproteinase NMA NG-monomethyl-L-arginine PI3K phosphatidylinositol 3-kinase PTX pertussis toxin
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