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어류의 이리도바이러스 특성과 확산 및 백신 개발
Reports NRF is supported by Research Projects( 어류의 이리도바이러스 특성과 확산 및 백신 개발 | 2005 Year 신청요강 다운로드 PDF다운로드 | 정준범(부경대학교) ) data is submitted to the NRF Project Results
Researcher who has been awarded a research grant by Humanities and Social Studies Support Program of NRF has to submit an end product within 6 months(* depend on the form of business)
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  • Researchers have entered the information directly to the NRF of Korea research support system
Project Number F00012
Year(selected) 2005 Year
the present condition of Project 종료
State of proposition 재단승인
Completion Date 2008년 08월 19일
Year type 결과보고
Year(final report) 2008년
Research result report
  • Abstract
  • 어류에서 질병을 유발시키는 여러 병원체 중에서 iridovirus는 우리 나라를 비롯한 세계 각지의 해산어 양식 산업에서 매년 심각한 경제적 손실을 야기시키는 주요한 질병 원인체이지만, 현재 우리 나라에서의 iridovirus에 대한 연구는 아직 충분히 이루어져 있지 않고 있어, 이 virus에 대한 조사와 대응책 마련에 대한 연구는 매우 시급한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 수입산 어류 그리고 국내산 어류를 대상으로 iridovirus 감염 현황 파악과, virus의 특성 분석 그리고 예방 대책에 중점을 두고 연구를 수행하였다. 1998년에서 2001년까지 우리 나라 남해안 일대의 여러 해산어 양식장에서 iridovirus의 전형적인 감염 증상을 보이는 어종들과 중국에서 수입한 점농어 (Lateolabrax sp.)의 비장으로부터 11개의 iridoviral DNA를 각각 분리하여, 염기서열상의 특성을 분석하였다. 그 결과, 11개의 iridovirus isolates는 3가지 type으로 분류할 수 있었다. 첫째 번 type은 8개의 isolates가 4 부위의 유전자 모두에서 서로 동일하였으며, 둘째 번 type은 2000년도와 2001년도에 중국에서 수입한 점농어에서 분리되었다. 셋째 번 type은 일본에서 보고된 바 있는 RSIV Ehime-1과 동일한 것으로 나타났다. 본 연구에서는 Cassette ligation-mediated PCR 기법을 사용하여 이미 알고 있는 iridovirus DPOL gene의 3‘ 말단 부위로부터 5905 bp 되는 미지의 염기서열을 결정하고, K2 region이라고 명명하였다. K2 region의 양 끝부분은 DPOL gene과 RNRS gene에 각각 overlapping되어 있었고, 2개의 서로 다른 방향을 나타내는 ORFs (ORF-1, ORF-2)를 포함하고 있었다. 각 iridoviruses 간에 이 부위의 염기서열은 nucleotide substitutions, insertions, deletions 등 많은 변이를 나타내었고, 72~92%의 상동성을 나타내었다. 본 연구에서 분석한 K2 region은 ORFs와 intergenic region 모두에서 많은 insertions/deletions nucleotide sequences를 보였고, 이러한 부위를 이용하여 PCR로써 iridovirus type을 보다 간단하게 구별할 수 있었다. 본 연구에서는 2-step PCR 기법을 사용하여 iridovirus의 감염 증상을 나타내지 않는 어류로부터 iridovirus를 검출하였으며, 각 월별로 돌돔 (Oplegnathus fasciatus), 참돔 (Pagrus major), 점농어, 조피볼락 (Sebastes schlegeli) 등 4 어종을 대상으로 iridovirus 검출율을 확인하기 위해 250 groups를 채집하여 조사한 결과, 돌돔 (79.7%), 조피볼락 (31.3%), 점농어 (27.3%), 참돔 (13.2%) 등 iridovirus에 의한 감염 비율이 매우 높게 나타났다. 1-step PCR 양성 반응은 8월~10월 사이의 돌돔에서만 나타났고, 그 외의 모든 iridovirus는 2-step PCR 기법에 의해 검출되었다. 1-step (증상적 감염)과 2-step (무증상적 감염) PCR 양성 반응에서 나타난 iridoviruses의 양적 차이를 나타내는지 알아보기 위해서, 검출한계 PCR을 실시한 결과, 10-5 배 정도로 무증상적 감염어가 낮게 나타났다. 병원성 실험에서, 증상적 감염어의 비장을 사용한 경우 근육 주사한 모든 돌돔이 18일 이내에 폐사하였지만, 무증상적 감염어의 비장을 사용한 경우에는 폐사가 나타나지 않았다. 담수 관상어에서 iridovirus가 검출되었다는 외국의 몇몇 보고를 토대로 국내산과 수입산 관상어의 iridovirus 감염에 대한 monitoring을 2-step PCR 기법으로 실시한 결과, 11 관상어종에서 iridovirus를 검출하였고, 이미 보고된 바 있는 infectious spleen and kidney necrosis virus (ISKNV)와 동일하다는 것을 확인하였다. 특히, 본 연구에서 최초로 확인된 관상어에서의 ISKNV 감염 사실은 현재 다양한 iridoviruses가 여러 어종으로 확산되고 있다는 가능성을 시사하고 있다. 1-step PCR에서 양성 반응을 나타낸 pearl gourami (Trichogaster leeri)의 spleen homogenate를 사용하여 pearl gourami와 silver gourami (T. microlepis)에 대해 공격 실험을 실시한 결과, 70%와 20%의 누적 폐사율이 나타났는데, 이것은 자연 감염된 관상어로부터 분리한 iridovirus가 감염성을 가지고 있으며, 종에 따라서 병원성의 차이가 있을 수 있다는 것을 제시하고 있다. Iridovirus에 의한 질병을 예방하기 위하여, 본 연구에서는 iridovirus에 감염된 돌돔의 spleen을 사용하여 heat-inactivated vaccine을 제작하였고, 참돔에 대한 실험에서 vaccine의 높은 효과를 확인하였다. 시판의 Biken vaccine을 control로서 사용하였고, 참돔에 대한 vaccine 실험에서 이전의 보고들과 유사한 결과를 나타내었다. 본 연구에서의 heat-inactivated vaccine은 다른 vaccine에 비해 제작 방법이 간단하고, 비용이 적게 들며, vaccine의 대량 확보가 가능할 뿐 아니라 식용 어류에 대한 vaccine으로서 보다 안전하게 사용될 수 있을 것이다.
  • Research result and Utilization method
  • Cassette ligation-mediated PCR 기법을 사용하여 이미 알고 있는 iridovirus DPOL gene의 3‘ 말단 부위로부터 5905 bp 되는 미지의 염기서열을 결정하고, K2 region이라고 명명하였다. K2 region의 양 끝부분은 DPOL gene과 RNRS gene에 각각 overlapping되어 있었고, 2개의 서로 다른 방향을 나타내는 ORFs (ORF-1, ORF-2)를 포함하고 있었다. 각 iridoviruses 간에 이 부위의 염기서열은 nucleotide substitutions, insertions, deletions 등 많은 변이를 나타내었고, 72~92%의 상동성을 나타내었다. 본 연구에서 분석한 K2 region은 ORFs와 intergenic region 모두에서 많은 insertions/deletions nucleotide sequences를 보였고, 이러한 부위를 이용하여 1번의 PCR 실시로 iridovirus type을 보다 간단하게 구별할 수 있었다. 2-step PCR 기법을 사용하여 iridovirus의 감염 증상을 나타내지 않는 어류로부터 iridovirus를 검출하였으며, 각 월별로 돌돔, 참돔, 점농어, 조피볼락 등 4 어종을 대상으로 iridovirus 검출율을 확인하기 위해 250 groups를 채집하여 조사한 결과 iridovirus에 의한 감염 비율은 4 어종 모두에서 높았으며, 돌돔 (79.7%), 조피볼락 (31.3%), 점농어 (27.3%), 참돔 (13.2%) 등의 순서로 나타났다. 1-step PCR 양성 반응은 8월~10월 사이의 돌돔에서만 나타났고, 그 외의 모든 iridovirus는 2-step PCR 기법에 의해 검출되었다. 1-step (증상적 감염)과 2-step (무증상적 감염) PCR 양성 반응에서 나타난 iridoviruses의 양적 차이를 알아보기 위해 검출한계 PCR을 실시한 결과, 10-5 배 정도로 무증상적 감염어가 낮게 나타났다. 국내산과 수입산 담수어의 iridovirus 감염에 대한 monitoring을 2-step PCR로서 확인한 결과, 11 담수어종에서 iridovirus를 검출하였고, 이미 보고된 바 있는 infectious spleen and kidney necrosis virus (ISKNV)와 동일하다는 것을 확인하였다. 특히, 본 연구에서 최초로 확인된 담수어에서의 ISKNV 감염 사실은 현재 다양한 iridoviruses가 여러 어종으로 확산되고 있다는 가능성을 시사하고 있다. 1-step PCR에서 양성 반응을 나타낸 pearl gourami (Trichogaster leeri)의 spleen homogenate를 사용하여 pearl gourami와 silver gourami (T. microlepis)에 대해 공격 실험을 실시한 결과, 70%와 20%의 누적 폐사율이 나타났는데, 이것은 자연 감염된 관상어로부터 분리한 iridovirus가 감염성을 가지고 있으며, 종에 따라서 병원성의 차이가 있을 수 있다는 것을 제시하고 있다. Iridovirus에 의한 질병을 예방하기 위하여, iridovirus에 감염된 돌돔의 spleen을 사용하여 heat-inactivated vaccine을 제작하였고, 참돔에 대한 실험에서 vaccine의 높은 효과를 확인하였다. 현재까지 여러 Iridoviruses가 보고되고 있지만, Iridoviruses 간의 유전자적 비교 연구는 아직 미흡한 실정이다. 본 연구에서 밝힌 K2 region은 Iridoviruses 사이에 특히 많은 유전자 변이를 나타내고 있으며, 이러한 부위를 사용한 분석은 더욱 명확한 Iridovirus의 분류를 가능케 한다. 또한, PCR 생성물의 size를 이용한 분별 진단은 Iridovirus type을 구별하는데 있어서 시간적, 경제적으로 보다 효율적으로 사용될 수 있다. 다양한 해산어종을 대상으로 Iridovirus 감염 monitoring을 실시하였으며, 그 결과는 앞으로 Iridovirus의 연구나 예방에 있어서 중요한 지표로서 사용될 수 있을 것이다. 우리 나라의 담수관상어는 대부분 수입에 의존하고 있음에도 불구하고 어떠한 검역 절차도 없이 무분별하게 수입되고 있다. 어류에 치명적인 질병 원인체인 Iridovirus가 많은 수입산 어종에서 매우 높은 빈도로 검출된다는 것을 본 연구에서 밝혔으며, 과학적인 data를 확보함으로써 수입에 대한 체계적인 검역 기준을 제시할 수 있을 것이다. 본 연구에서의 heat-inactivated vaccine은 제작 방법이 간단하고, 비용이 적게 들며, vaccine의 대량 확보가 가능할 뿐 아니라 식용어에 대한 vaccine으로서 보다 안전하게 사용될 수 있을 것이다.
  • Index terms
  • Iridovirus, rock bream, red sea bream, DNA homology, cassette ligation-mediated PCR, repetitive element, multiplex PCR, Asymptomatic infection
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