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https://www.krm.or.kr/krmts/link.html?dbGubun=SD&m201_id=10011579&local_id=10018126
Leuconostoc-E. coli 벡터 개발 및 트랜스포존 매개 유전자도입을 통한 류코노스톡 유산균에서 이형단백질 발현
Researcher who has been awarded a research grant by Humanities and Social Studies Support Program of NRF has to submit an end product within 6 months(* depend on the form of business)
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  • Researchers have entered the information directly to the NRF of Korea research support system
Project Number F00017
Year(selected) 2005 Year
the present condition of Project 종료
State of proposition 재단승인
Completion Date 2008년 10월 01일
Year type 결과보고
Year(final report) 2008년
Research result report
  • Abstract
  • Leuconostoc 속 미생물은 김치와 같은 야채발효식품류의 초기 우점균으로 이형젖산 발효를 하며 발효식품의 맛에 관여하는 주요 유산균이다. 현재 많은 유전학적 연구들이 유산균에서 진행되고 있지만, Leuconostoc 유산균에 대한 연구는 그 중요성에 비해 미흡한 상태이다. 따라서 본 연구에서는 Leuconostoc 균주의 유전학 연구와 형질개량에 기초가 되는 유전자 형질전환기술을 확립하고자 첫째, 세포질에서 자가복제되는 셔틀벡터를 개발하고, 둘째, 트랜스포존을 이용하여 염색체 내부로 유전자를 도입함으로써 이형단백질을 Leuconostoc에서 발현시키는 연구를 수행하였다.
  • Research result and Utilization method
  • Leuconostoc에서 자가복제되는 셔틀벡터를 제작하기 위해 동치미김치로부터 약 200종의 Leuconostoc 예상균주를 분리하였고 이들 중 8 종의 균주에서 10 kb 이하의 플라스미드 DNA를 확인하였다. 이들 플라스미드들은 southern hybridization에 의하여 두 가지의 상동그룹, 즉 pCB18 상동그룹과 pCB42 상동그룹으로 분류할 수 있었다. 위 두개의 플라스미드를 각각 함유한 두 균주를 생화학적 분석과 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과 Leuc. citreum으로 판명되었다. 플라스미드 pCB18은 1,821개의 염기로 이루어져 있고, 하나의 ORF를 가지며 replicase와 높은 아미노산 서열의 상동성을 보였다. 플라스미드 pCB42는 4,231개의 염기로 이루어져 있고, 두개의 ORF를 함유하고 있으며 ORF1은 transposase 단백질, ORF2는 DNA 결합 단백질과 상동성을 나타내었다. pCB18와 staphylococcal chloramphenicol acetyltransferase (CAT) 유전자를 함유한 pEK104를 조합하여 Leuconostoc-E. coli 셔틀용 pLeuCM 벡터를 제작하였고, pCB42 또한 동일한 방법으로 pLeuCM42 셔틀벡터를 제작하였다. 이들 셔틀벡터의 segregational stability를 알아본 결과 80 세대 이후에도 대체적으로 안정적으로 복제됨을 알 수 있었다. Leuconostoc에서 외래유전자를 발현시키기 위해서 α-amylase와 β-galactosidase 유전자를 각각 Lactobacillus amylovorus와 Lb. plantarum의 염색체 DNA에서 분리하여 pLeuCM 셔틀벡터에 클로닝하였다. 얻어진 pLeuCMamy와 pLeuCMgal을 E. coli와 Leuc. citreum 95에 형질전환 시켰으며 성공적인 발현을 효소활성으로 확인하였다. 그러나 항생제를 포함하지 않는 배지에서 위 균주들은 50 세대 이후 벡터를 상실하여 pLeuCM 벡터에 이형 유전자가 삽입되어 크기가 증가한 경우 segregational stability가 급격히 감소하는 현상이 나타났다. 또한 해파리로부터 클로닝된 형광 단백질 (GFP) 유전자를 pLeuCM 벡터에 클로닝하여 E. coli와 Leuc. citreum 95에 형질전환 한 결과 E. coli에서는 발현이 잘 되었지만 Leuc. citreum 95에서는 발현이 미비하였다.
    Leuc. mesenteroides DRC 유산균은 제조김치 생산기업에서 현재 스타터로 사용되고 있다. 본 유산균은 전배양 후 살균되지 않은 김치에 접종될 때 원재료에서 유래한 다른 유산균 (Leuconostoc 포함)들과 혼합발효를 진행하는데 본 과정에서 스타터 균주를 모니터링 하는 기술이 필요하다. 이를 위해 선발마커로서 클로람페니콜 내성효소 (CAT) 유전자를 transposase를 이용하여 DRC 균주의 염색체에 무작위로 삽입하였고, 항생제 배지에서 선발하였다. 이렇게 얻어진 Leuc. mesenteroides tDRC (이하 tDRC) 균주를 wild DRC 균주와 생육을 비교하기 위해 김치유사 배지인 J-medium에서 배양한 결과, pH, 산도 그리고 생육패턴에 있어 두 균주가 유사한 결과를 보였다. 따라서 본 항생제 내성 균주를 실제로 김치에 첨가하여 동일한 실험을 수행하였는데, 초기 2일째는 빠른 성장을 보이다가 그 이후에는 점차 감소를 보이는 전형적인 Leuconostoc 생육패턴을 보였다. 본 결과로부터 항생제 내성 균주는 김치에서 스타터 균주의 생육을 모니터링 하는데 유용하며, 염색체로의 유전자 도입 기술은 Leuconostoc에서 유전자를 안정하게 발현하는 효과적인 방법임을 알게 되었다.
    본 연구는 Leuconostoc 유래 셔틀벡터와 염색체내로의 삽입방법을 통하여 Leuconostoc 유산균에 이형의 단백질을 발현시킨 최초의 연구결과이다. 본 기술들은 Leuconostoc 유산균에 유전학적 연구와 균주개량을 위한 도구로 유용하게 이용될 것이다.
  • Index terms
  • Leuconostoc citreum, cryptic plasmid, pCB18, pCB42, sequence analysis, replicase, transposase, shuttle vector, electroporation, RT-PCR, α-amylase, β-galactosidase, green fluorescent protein, segregational stability, integration, transposon
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